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任杰，任天斌（同濟大學材料科學與工程學院納米與生物高分子材料研究所，上海200092）
摘要: 總結了應用于組織工程的幾種聚乳酸及其共聚物和復合材料，以及組織工程支架材料的各種制備方法，簡述了聚乳酸類可降解材料在骨組織工程、皮膚組織工程、血管組織工程等方面的應用研究進展。關鍵詞：聚乳酸，組織工程，聚合物支架
1. 組織工程和組織工程支架 組織工程是應用工程科學和生命科學的原理，開發用于恢復、維持及提高受損傷組織和器官功能的生物學替代物的科學[1]。這是一種通過細胞培養而直接獲得新組織和器官的新技術, 對組織器官缺損和功能障礙治療起到了革命性變革的作用, 從而被廣泛認可為21 世紀最具應用前景的治療方法。組織工程也已成為全球公認的最具發展前景和意義的科學技術研究領域之一。 組織工程作為一門多學科交叉的新興邊緣學科不僅展示了重要的科學意義；而且有著巨大的社會效益，目前全球器官替代治療費用已占總醫療費用的8%，價值約達3500 億美元/年，因此組織工程可望產生豐厚的經濟回報。組織工程自1987年正式提出以來，已成為各國科學家競相進行研究和開發的熱點，美國國家科學基金會先后資助建立了一系列組織工程實驗室，并集中了相當數量的著名研究機構開展這方面的工作。日本政府對組織工程的研究也賦予了極大的重視, 2001 年組織工程已成為日本生物技術領域中僅次于基因分析的第二大科研投入項目。我國也已在上世紀末將組織工程列為國家973計劃、863 計劃以及國家及地方自然科學基金的重要研究項目。不僅如此，大量的私人公司對組織工程研究和開發投入重金，在目前已投入組織工程領域35 億美元的資金中90% 以上來自于私人。 近年來，在各國大量投入的推動下，伴隨著分子生物學、材料學和工程學的不斷進步，組織工程學得到了空前的發展。在種子細胞的研究方面以骨髓間質干細胞為代表的成體干細胞和胚胎干細胞研究已取得了突出的進展；作為組織工程支架材料的可降解聚合物與無機生物活性納米復合材料表現出了較好的綜合性能；在臨床方面，組織工程皮膚已被批準進行臨床應用，組織工程骨臨床實驗也得到了一些較好的實驗結果。因此可望在不久的將來, 組織工程化的各種組織和器官便可以問世, 人們就可從中受益, 使生活質量得到新的提高。組織工程包括三大要素，即種子細胞、支架材料和細胞生長因子。理想的細胞支架應具有一定的生物降解速度、良好的細胞親和性、呈特定的三維多孔結構。 組織工程中細胞支架起著為細胞增殖營造環境的作用，它應隨著細胞的繁殖而逐漸降解、消失，以利于將空間讓位于細胞，并使所生成的組織和器官具有同細胞支架相同的幾何形狀。因此作為細胞支架的高分子材料必須具有生物降解性，即在生理或體內環境下組成材料的分子鏈能自動斷裂，并由此形成的小分子能逐漸被機體代謝或吸收。此外，還要求材料的降解速度與細胞的增殖速度相匹配、以及由降解所形成的小分子不會對細胞繁殖產生不利的影響。因此組織工程的細胞支架材料必須具有生物降解性和一定的降解速度、良好的生物相容性及細胞親和性。此外，組織工程的細胞支架，不僅應具有在細胞培養過程中能保持形狀、不會破碎、可以操作的力學強度外，從臨床應用出發，細胞支架還應具有一定的柔韌性，使之能夠同機體組織相縫合、并能同機體組織貼合，也不會對機體組織造成機械損傷的力學性能。因此，作為組織工程細胞支架的生物材料必須兼具有生物可降解性、良好的生物相容性、細胞親和性、一定的力學性能、可加工性，以及可消毒性等。[2-5] 組織工程用生物降解材料可分為天然降解材料、合成降解材料和復合材料。天然降解材料如羥基磷灰石、珊瑚礁和磷酸鈣、殼聚糖、海藻酸鹽、膠原蛋白、葡聚糖、透明質酸、明膠和瓊脂等，它們的優點是具有特異性的分子識別功能、生物相容性好等, 缺點是存在力學強度較差、性能不穩定及因宿主酶環境變化而降解行為不好調節等。合成降解材料具有強度高、來源充足、易于加工等優點, 但通常又具有缺少內在的生物活性、降解產物有毒、可能引起植入部位微環境(如pH )發生變化等缺點; 此外, 在材料降解速度的可控性、強度、可注射性、組織相容性、細胞親和性、可加工性及可消毒性等方面仍有許多問題有待解決。復合材料由于可以綜合單一材料各自的優點, 彌補它們各自的一些缺點, 從而取長補短,因此成為開發新型組織工程材料的有效途徑。
2. 聚乳酸類組織工程支架材料的種類 聚乳酸( PLA)是經FDA 批準的極少數可用于人體的可降解聚合物材料之一。PLA 在人體內代謝的最終產物是CO2 和H2O，中間產物乳酸也是體內正常糖代謝的產物，不會在重要器官聚集，因此具有優異的可生物降解吸收性。目前已經實用化的聚乳酸材料產品有縫合線、骨結合部位固定材料、組織缺損修復材料等。聚乳酸由于其良好的生物降解性、生物相容性和可加工性，已廣泛應用到組織工程支架制備中。 同時，由于聚乳酸細胞親和性差，疏水性較強，降解速度很慢，在體內長期存在容易引發炎癥和腫脹并發癥。因此，聚乳酸通常不單獨作為組織工程支架材料，而是利用與其它單體的共聚、與其它聚合物共混，或者用天然高分子或天然無機物與聚乳酸共混或雜化的技術，通過控制材料的組分、組成比、分子量、分子量分布等手段,達到調節和控制材料性能的目的。現在聚乳酸類材料已有了物理性能由液態到固態、強度由弱到強、硬度由軟到硬、生物降解速度(降解半衰期) 由幾周至幾年可供選擇。[6-9]2.1 聚乳酸及其共聚物 聚乳酸共聚物是應用得最多的組織工程材料，聚乙醇酸(PGA ) 降解速度快并親水性好,聚己內酯(PCL) 藥物通透性優良, 通過單體共聚的方法可以得到聚(乙交酯/丙交酯) 共聚物(PLGA )、聚(己內酯/丙交酯) 共聚物(PLC)、聚(乙交酯/己內酯) 共聚物(PGC)、聚己內酯/聚丙交酯/聚乙二醇三元共聚物(PCEL )以及聚(乙交酯/丙交酯/己內酯)三元共聚物(PGLC)等一系列聚乳酸共聚物，這些材料廣泛用于組織工程。[10] 聚氧化乙烯具有極好的生物相容性。這種高生物相容性被認為來源于高運動性和親水性的PEO對吸附分子的阻抗作用。PLA與PEO結合制備的聚乳酸-聚氧化乙烯(PLA - PEO) 共聚物,可有效調節材料的物理機械和表面性能,制備理想的組織工程材料。 聚乳酸- 氨基酸共聚物是為適應組織工程要求而發展起來重要支架材料。一方面,聚氨基酸本身也具有良好的生物相容性和可生物降解性,其降解產物氨基酸對人體無毒害作用,而且氨基酸鏈段的引入,可以調節聚乳酸材料的降解性能；另一方面,氨基酸鏈段帶有反應性的官能團側基,如-NH2 , -COOH 等，可以用來固定具有生物活性的分子，如蛋白質、糖類、多肽等，可改善材料與細胞之間的相互作用。其中，聚乳酸-賴氨酸共聚物(PLAL) 是聚乳酸-氨基酸共聚物中研究最多的一類。2.2 聚乳酸復合材料 組織工程中所用的復合材料是由兩種或兩種以上不同材料優化組合而成的支架材料。羥基磷灰石(HA)/ PLA 復合材料是比較成功的復合材料，羥基磷灰石(Hydroxylapatite, HA ) 是自然骨的主要成分, 具有極好的生物活性。但它的脆性大、強度較低、易斷裂。將HA 與PLA 類聚合物復合制成生物降解復合材料, 可以把兩者的優點集于一體，使該復合材料既具有骨傳導性又具有良好的力學性能,成為性能優異的骨組織工程材料。基于這一目的, 自90 年代初首先開始了HA/PLA骨折內固定復合材料方面的研究工作, 最近幾年研究相當活躍, 研究內容涉及該復合材料的制備、機械性能、界面組織結構、生物相容性及生物降解行為等方面。同時聚乳酸與活性玻璃的研究報道也逐年增多，近幾年對納米材料或納米復合材料的研究有了新的突破，這已成為組織工程支架材料研究的方向之一。[11] 生物活性有機成分/PLA復合材料在骨組織工程領域中使用的生物活性有機成分主要有磷酯、同種異體骨、異種骨、骨形成蛋白(粗提牛骨形成蛋白bBMP和基因重組人骨形成蛋白rhBM) 等, 眾所周知, 這類物質具有高效骨誘導活性, 但是將它們單獨植入生物體內時, 由于容易被生物體吸收而使其骨誘導活性難以得到充分發揮。所以, 近年來人們將這些生物活性有機成分與PLA進行復合制作骨修復材料, 探討它們在骨修復過程中所起的作用。 聚乳酸(PLA) 及其衍生物也可以形成水凝膠組織工程材料。用一般固體材料所制備的細胞支架在應用過程中經常會因為需修復組織形狀的不規范而需要醫生在臨床作精心的雕刻, 然后才能用此支架進行修復吻合工作, 造成了應用的極大不便。此外, 固體材料的棱角對組織可能造成的機械損傷也是不容疏忽的。由于水凝膠可以避免上述的缺陷, 因而開發可注射性水凝膠材料成為組織工程研究的又一熱點。3. 聚乳酸類組織工程支架的制備方法[5,12] 在組織工程中，除了考慮材料的化學性質、表面性能外，還應考慮多孔三維細胞支架的結構，如孔隙形態、大小、連通性、孔隙率等，以利于細胞的黏附、滲透和營養物質的傳送及代謝產物的交換，而支架的結構取決于三維支架制備方法。聚乳酸類組織工程材料可以采用多種方法制備具有合適體型結構的組織工程支架，包括：纖維粘接、溶液澆鑄/粒子瀝濾、氣體發泡、相分離技術、快速成型技術等。3.1 纖維粘接 由PGA 或PLGA 纖維構成的骨架的優點是表面積大, 有利于細胞的粘附和養分的擴散, 故對細胞存活和生長有利; 缺點是內架結構穩定性不好。對此可加以改進。一種方法是纖維固定技術，如將PGA 纖維浸入到PLLA 的氯仿溶液中, 待溶劑揮發后, PGA 纖維網嵌入到PLLA 中，將混合物加熱到兩種聚合物的熔點以上，PLLA 首先熔融, 充滿PGA 纖維網絡所有空洞。PLA 的作用是穩定PGA纖維和防止PGA 開始熔融時纖維網絡結構塌陷。經一定的熱處理, 交叉點的PGA 纖維熔融后物理結合在一起, 選定一種只能溶解PLLA 的溶劑將其溶解, 即可得到高度多孔網狀結構。采用這種成纖技術制得的多孔網狀結構的孔隙率和孔直徑分別高達81% 和500um。3.2 溶液澆鑄/粒子瀝濾 該技術是將聚合物(PLLA或PLGA)溶解在溶劑中, 然后將溶液澆鑄到充滿致孔劑的培養皿上。待溶劑揮發后, 將聚合物/鹽混合物在水中瀝濾去掉致孔劑, 從而得到不含粒子的聚合物骨架。骨架的孔隙率由所加鹽的用量來控制, 孔的直徑由鹽晶粒的大小決定。當鹽的重量百分比達到或超過70% 時, 孔與孔之間高度相互連通。3.3 熔融成型 該技術與粒子濾出類似，將PLGA 等粉末與明膠粒子混合物放在四氟乙烯模具中, 將模具加熱到超過PLGA的玻璃化溫度, 加壓使PLGA 和明膠粒子結合在一起。冷卻后將復合物放入水中, 明膠粒子溶解后得到PLGA 骨架。可通過改變明膠粒子的大小和明膠/PLGA 的比對孔結構加以控制。3.4 氣體發泡 氣體發泡技術采用氣體作為致孔劑，方法是在加熱模具中通過模壓成型制備PGA、PLLA 或PLGA 固體片材。將這些固體片材置于高壓CO 2 (515M Pa) 室內三天,然后使壓力快速下降到大氣壓強, 使聚合物中形成氣穴。所得支架的孔隙率高達93%。3.5 相分離法 相分離法又包括凍干法相分離法、熱致相分離等。而且除了液液相分離外, 還有液固相分離。乳化/冷凍干燥方法是將PLA類聚合物溶于CH2Cl2后, 加入蒸餾水形成乳狀液, 將聚合物/水混合物澆鑄到模具中, 置于液氮中驟冷。然后將支架于- 55℃下冷凍干燥, 真空蒸發掉分散的水和聚合物溶劑。采用該技術制備的支架孔隙率高達95% , 但形成孔的直徑很小。相分離得到的孔的形態也受許多參數影響,包括聚合物類型、聚合物溶液濃度及冷卻速率等。3.6 熱致凝膠化與其它方法結合制備納米級纖維支架 納米級纖維支架由聚合物溶夜經過熱致凝膠化、溶劑交換和冷凍干燥過程制備。研究發現：在冷凍干燥前, 聚合物濃度、熱退火、溶劑交換和冷凍溫度對納米級結構有影響。一般情況, 高凝膠化溫度得到的為片晶狀結構; 低凝膠化溫度得到的是納米級結構。采用該技術制備的骨架的孔隙率高達98% , 孔直徑在50～500nm 范圍內。3.7 聚合物微球聚集 微球聚集也可構成多孔骨架。骨架的孔隙率就是微球間的間隙, 它直接與微粒的直徑相關。該技術的優點是微粒可包裹生長因子, 進行可控釋放。3.8 一體化制備方法( 快速成型法) 快速成型技術又稱固體自由成型技術,它采用離散/堆積成型原理，先由三維CAD 軟件設計出三維曲面或實體模型，然后根據工藝要求，將其按一定厚度進行分層，把三維模型變為二維平面/ 截面信息，即離散的過程；再將分層后的數據進行一定的處理，加入加工參數，產生數控代碼，在微機控制下數控系統以平面加工方式有序、連續地加工出每一個薄層，并使它們自動粘結而成型，即材料堆積的過程。其特征在于可同時完成致孔和外形的成型，一步得到具有一定外形的三維多孔支架。三維打印和熔融堆積成型是目前用于多孔支架制備的兩個主要的快速成型方法。其它還有一些方法，如靜電紡絲等等這里不一一敘述。
4. 聚乳酸類材料在組織工程中的應用 聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物(PLGA)和復合材料目前是應用最為廣泛的組織工程支架材料，目前已在骨、軟骨、肌腱、氣管、皮膚、肝、心瓣、血管、角膜、胰及神經的組織工程中廣泛應用。其中在以下幾方面的研究較多，研究成果也比較顯著。4.1 骨組織工程[13] 骨組織工程由于在臨床應用上具有廣闊的前景，始終都是組織工程的重點研究對象，經過近十年來的快速發展，目前已取得了初步的成果，證實了支架復合物上可以形成骨組織，從而實現體外構建組織工程骨的目標。近年來骨組織工程的研究逐漸集中到兩個方面：一是細胞傳輸，具有細胞傳輸功能的物質主要有聚乳酸（Polylactide，PLA ）、聚乙醇酸（Polyglycolide, PGA）以及二者的共聚物(PLGA)等；二是骨組織誘導，如羥基磷灰石（HA）等生物活性陶瓷能引發成骨細胞及其他細胞吸附于支架上，隨著基質堆積，骨組織逐漸形成，并重新塑形。現代材料加工技術制作的多孔狀PLA 具備了模擬松質骨的三維立體構型,早期可產生局部壓電效應,刺激生發層多能干細胞的分化及膜內、骨內成骨。同時,加入有骨傳導作用的羥基磷灰石(HA) 、磷酸三鈣(TCP) 及膠原等能大大提高材料的骨傳導性,而多孔材料能良好承載如骨形成蛋白(BMP) 、堿性成纖維細胞因子(bFGF) 等生長因子，又使材料具備了骨誘導作用。軟骨是組織工程學研究較多的重建組織，如用PLA 纖維網培養鼻軟骨細胞, 所得到的新生組織的組織學表現與正常軟骨相似。將軟骨細胞種植于精確塑型的聚乳酸共聚物材料上并植入裸鼠體內可以形成與人耳形態相似的軟骨組織，研究發現軟骨細胞生長存在形狀依賴性,可以通過改變生物材料的形態來控制新生組織的形態, 非常有利于今后的臨床應用。聚乳酸類聚合物不僅在組織工程軟骨的構建方面有大量的研究，而且在組織工程化骨、組織工程肌腱的構建和組織工程化周圍神經的構建等方面有大量的應用成果。國內外的研究工作已證明了羥基磷灰石粒子同聚乳酸復合能得到力學性能較好、降解速率可調的骨修復材料，用細胞和支架材料復合培養以及體外構建組織工程骨，檢測細胞的各種生物學性能和體外成骨能力，并將構建的組織工程骨移植到動物體內進行動物臨床實驗是骨組織工程今后重要的研究方向。隨著PLA 及其復合材料的不斷發展, 在骨科領域中將是一種極有前途的骨組織工程細胞生長載體材料。4.2 皮膚組織 目前，在皮膚創傷修復過程中，應用的真皮替代物主要有異體真皮、無細胞真皮基質和合成真皮基質等。但以上真皮替代物由于免疫反應、缺乏活細胞或支架材料難以塑性等缺點而未能得到廣泛的應用。組織工程真皮被認為是大面積皮膚修復最理想的材料，組織工程皮膚材料也是目前唯一已經商業化的組織工程材料。它的構建思路是利用生物學和工程學原理研究、開發用于修復、維持和改善損傷的真皮組織。具體的方法是將體外培養的真皮成纖維細胞與適當的胞外基質相結合,然后將其移植到病損部位。對于皮膚組織工程來說，一種在生物相容性、空間結構、機械強度等方面均有利于組織重建的、理想的組織工程支架材料非常重要。多孔的聚乳酸海綿材料和聚乳酸纖維材料是較為理想的人工真皮支架材料，已經在人工真皮構建中起到重要的作用。如Advanced Tissue Sciences 公司生產的真皮替代物Dermagraft 即是由新生兒成纖維細胞種植在可降解的聚乳酸纖維網上組成,現已成功用于治療糖尿病性潰瘍。多孔的海綿狀聚乳酸支架材料具有較大的表面積和高孔隙率,利于細胞的粘附和營養物質的傳遞及代謝產物的交換,可以更加充分地發揮其組織再生的潛力。4.3 血管組織 血管組織工程的主要內容是體外構建自體血管。在呈多微孔狀態的可降解聚合物生物支架材料（主要是PLGA）上植入自體血管壁細胞(包括平滑肌細胞和內皮細胞)，經體外培育后植入機體，隨著聚合物支架材料逐漸降解吸收，可建立自體血管。按這種方法獲得的血管可以根據需要制成不同大小的口徑，而且移植后具有生長潛能，因而，對嬰幼兒來說尤為適宜。實驗者曾把綿羊的頸動脈細胞先后種植于PGLA 上,一周后進行綿羊主肺動脈置換術,即用體外構建的血管置換原主肺動脈。組織學檢測顯示，移植2周后，PGLA 已完全消失。4-羥脯氨酸生化檢測顯示移植血管壁含70%膠原，與正常血管相似。移植10～12周后,亦無明顯血栓形成和鈣化的跡象。
論文來源：1st International Conference on Technology and Application of Biodegradable Polymers and Plastics,October,2004 |
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