writer：章培標, 侯宜, 武漢,周余來, 賈曉晶, 龔守良, 顏煒群，侯立中
keywords：內皮生長因子/生物合成; 細胞; 培養的; 基因; 轉染; 成纖維細胞; 人工皮膚 ;
source：期刊
specific source：中國臨床康復, 2006, 10(13):87-89
Issue time：2006年
［摘要］觀察外源性人血管內皮細胞生長因子基因導入正常真皮成纖維細胞后,能否表達及分泌血管內皮細胞生長因子,為進一步構建轉VEGF165基因組織工程皮膚在創傷修復中的應用提供新移植物.方法:實驗于2001-06/2005-06在長春吉林大學完成.①真核表達載體pcDNA3.0-hVEGF165的擴增、純化和鑒定過程為大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備→pcDNA3.0-hVEGF165質粒DNA細菌轉化→pcDNA3.0-hVEGF165質粒大量制備(堿裂解法)→質粒純化→質粒含量純度測定.提取的質粒載體用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳鑒定.②選取清潔級新生日本大耳白兔2只,無菌條件下取新生兔皮膚,盡量去除皮下組織,切成寬0.3 cm小條塊,Ⅰ型膠原酶消化,進行真皮成纖維細胞的分離與培養.脂質體介導真核表達質粒pcDNA3.0-hVEGF165轉染體外培養的兔皮膚成纖維細胞,經G418篩選,獲得陽性轉染細胞克隆,并進行傳代擴增.③酶聯免疫吸附法檢測轉染后不同時間段的血管內皮細胞生長因子蛋白表達水平;原位雜交顯示轉基因細胞內VEGF165mRNA的表達情況;流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況;透射電子顯微鏡觀察轉染后真皮成纖維細胞的超微結構.結果:①質粒酶切鑒定結果:提取的質粒經雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳鑒定后可得到5.4kb和0.57kb兩個片段,與原質粒圖譜符合,表明所提取的質粒為重組質粒pcDNA3.0-VEGF165.②pcDNA3-hVEGF165基因轉染真皮成纖維細胞情況:共進行15次轉染試驗,35孔(皿)均有G418抗性集落形成,表明pcDNA3.0-hVEGF165經脂質體介導可有效轉染正常皮膚成纖維細胞.③血管內皮細胞生長因子蛋白的表達:pcDNA3.0-hVEGF165轉染成纖維細胞后,24 h即有較高水平的血管內皮細胞生長因子蛋白表達,高達(3 280±2 054)ng/L,并于48,72 h呈下降趨勢.④血管內皮細胞生長因子cDNA原位雜交檢測結果:轉染后成纖維細胞可見散在的陽性細胞表達hVEGF mRNA.G418應用2～4周后,可成功篩選出轉基因成纖維細胞克隆,篩選后可見大量陽性的轉染細胞表達hVEGF mRNA.⑤成纖維細胞的細胞周期分布及凋亡檢測:轉染后成纖維細胞S期細胞比例增加,G1和G2期細胞減少,表明細胞DNA的合成以及細胞的增殖活動加強.但細胞凋亡率逐漸升高,轉染前為1.26%,轉染后2 d為2.64%,至12代時高達17.35%.⑥轉染后成纖維細胞超微結構觀察:細胞表面有較多微絨毛,核呈不規則形,胞質內可見較多的粗面內質網、線粒體,沿膜可見一些膜包被顆粒.結論:真核表達質粒pcDNA3.0-hVEGF165成功導入家兔皮膚成纖維細胞,在短時期內可高水平地表達分泌血管內皮細胞生長因子,在治療缺血性疾病和促進創傷修復及以其作為種子細胞構建轉基因組織工程皮膚治療皮膚缺損等方面顯示出較好的應用前景.
http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_xdkf200613032.aspx