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  在醫療衛生和農漁畜牧業領域，近幾十年來每年都有大量的抗生素被用來抗擊細菌感染。全世界抗生素的用量在2010年就達到了每年十至二十萬噸，而且多達90%使用的抗生素會以各種活性形態直接釋放到自然環境之中。因為抗生素的自然降解過程非常緩慢，在世界各地的土壤和水源里都檢測到了非同尋常的高濃度人造抗生素。很多證據表明在生態環境中累積的人造抗生素垃圾正在帶來嚴重后果， 包括對負責生物地化循環和有機降解的微生物群落的結構和功能的短期和長期不良影響，污染食物鏈中的水源和動植物產品，以及促進抗藥基因庫的發展等等。解決這個問題的辦法大體分為兩類， 一類是開發能在體內生物降解的抗生素， 但是在使用中不斷降解失活的抗生素本身會助長抗藥細菌的進化；另一類是采用新型污水管理辦法來減少，捕捉， 或者分解抗生素，但是這類辦法的實際操作比較困難， 因為要涵蓋抗生素垃圾的多樣釋放途徑和巨大釋放規模是一個幾乎不可能的任務。理想抗生素應該在臨床應用上保持全額活性，但是當釋放到自然生態環境中會迅速降解失活。沒有一種現在使用的抗生素具有這種特性。

  梁紅軍教授課題組近年來在研究模擬嗜菌體抗生素的工作中發現了親水納米的大小和形狀在界定抗菌活性和選擇性方面的重要作用（ACS Infect. Dis., 3(9), 676-687 (2017); C&EN, 95 (35), 9 (2017)）。再此基礎上，本項工作提出了一種基于納米結構的智能抗生素新概念來設計能“組裝激活”并響應自然生態環境特有信號而“解散失活”的納米抗生素，并且闡述了這種親水納米粒子選擇性的進攻細菌而不是動物細胞的分子原理。

圖1. 自帶能響應自然生態環境特有信號而“解散失活”的納米抗生素

  這種抗生素由基于纖維素的棒狀納米高分子刷組成（圖1）。構成刷子的親水高分子本身（PTMAEMA；poly(N,N,N-trimethylamino-2-ethyl methacrylate)）沒有溶血效應和殺菌活性。通過原子轉移自由基聚合反應把PTMAEMA接枝到纖維素骨架上而形成的親水棒狀納米高分子刷既沒有溶血或凝血效應，也對人類胚胎腎細胞沒有毒性，但是能在低劑量（4-32 μg/mL）下有效殺滅（>99.9%）大腸桿菌 （E. coli.），金黃色葡萄球菌（S. aureus）和臨床上提取的抗藥菌種，包括抗妥布霉素和慶大霉素的銅綠假單胞菌（PA14），以及抗甲氧西林，奧沙西林，和萬古霉素的金黃色葡萄球菌（MU50）。在模擬自然生態環境中處處發生的纖維素酶解實驗中，基于纖維素的棒狀納米高分子刷迅速瓦解而失去納米結構， 它們的高效抗藥活性也隨之而去。因為纖維素酶只存在于自然生態環境而非人體之中，這種環境降解而非生物降解的智能抗生素會在臨床應用上保持全額活性，但是當釋放到自然生態環境中會迅速降解失活，因而不會變成抗生素垃圾而造成環境污染。

圖2. 納米結構是親水高分子刷引起細菌細胞膜破裂的關鍵

  為了闡述親水納米抗生素的殺菌原理，課題組設計了一系列對比實驗證明了納米結構是引起的細菌細胞膜破裂而殺滅細菌的關鍵。用于檢測細胞膜完整與否的憎水熒光分子滲透分析（圖2a）和細胞質泄漏鑒定（圖2b）均顯示只有抗菌活性的納米高分子刷能造成細菌細胞膜破裂。與之相反，沒有抗菌活性的納米高分子刷酶解產物或構成刷子的親水高分子本身都不會影響細菌細胞膜保持完整。掃描電鏡也顯示革蘭氏陰性的大腸桿菌在納米高分子刷酶解產物（圖2e）或構成刷子的親水高分子本身（圖2f）的存在下均不會改變原生形態（圖2c），而在同等劑量的納米高分子刷的存在下細胞膜則完全碎裂（圖2d）。對于革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌，由于其細胞膜外有厚厚的肽聚糖保護層，掃描電鏡不會探測到細胞形態的明顯變化 （圖2g-j），但截層透射電鏡清晰地觀測到原生細菌里經氧化鋨上色的完整細胞膜（圖2k，白色箭頭所示）不會在沒有抗菌活性的納米高分子刷酶解產物（圖2m）或構成刷子的親水高分子本身（圖2n）的存在下發生變化。與之相反，這些細胞膜在與具有高效抗菌活性的納米高分子刷的作用下則完前消失（圖2l）。

  親水納米粒子選擇性地破壞細菌細胞膜而不損害動物細胞膜的行為表明細胞膜的化學結構也扮演了重要的輔導角色。細菌和動物細胞膜的一個顯著差別是組成細胞膜的脂質分子有別，前者主要由負曲率的脂質分子組成，而后者的主要成分為零曲率的脂質分子。在熒光共聚焦顯微鏡下，模擬動物細胞的巨囊泡在納米高分子刷，高分子刷酶解產物， 或構成刷子的親水高分子作用下均不會釋放其包載的熒光素（圖3a）。這一結果顯示不管有沒有納米結構，親水高分子不會破壞動物細胞膜。當這些巨囊泡膜里的零曲率脂質分子被置換成負曲率的脂質分子來模擬細菌細胞時，雖然高分子刷酶解產物或構成刷子的親水高分子本身也不會使其釋放包載的熒光素，具有納米結構的高分子刷則會導致熒光素快速泄漏（圖3b）。這一觀測再一次表明親水納米粒子會選擇性地破壞細菌細胞膜， 而這種選擇性與細胞膜的脂質分子組成有關。

圖3. 親水高分子與模擬細菌及動物細胞脂質體之間的自組裝行為高度依賴于納米結構

  親水高分子與動物或細菌細胞膜相互作用的微結構差別在同步輻射小角x-光散射下一目了然。納米高分子刷，高分子刷酶解產物， 或構成刷子的親水高分子本身均會通過靜電吸引粘著在模擬動物細胞的脂質體表面而形成松散的疊層結構，顯示細胞膜的完整性沒有受到影響（圖3c）。與之相反，高分子刷酶解產物或構成刷子的親水高分子本身與模擬細菌細胞的脂質體作用會形成三維立方膜結構（圖3d，e），而納米高分子刷則與模擬細菌細胞的脂質體作用而形成簡單的二維六方膜結構（圖3d，f）。因為只有納米高分子刷可以破壞細菌細胞膜，一個合理的推測是只有二維六方膜結構才能導致不可逆的細菌細胞膜破裂。

圖4. 基于同步輻射小角x-光散射的傅立葉重建揭示了親水納米高分子刷選擇性地攻擊細菌細胞膜而成孔的分子原理

  傅立葉重建揭示了由于二維六方膜結構的形成而導致細菌死亡的分子原理。親水納米高分子刷與細菌細胞膜相互作用后的膜表面電子密度分布圖清楚地顯示了二維六方膜是一種六方排列的膜孔結構（圖4a）。對沿著晶胞軸剖面方向的一維電子密度分布圖地分析進一步確認了分子水平的成孔原理（圖4b）：相鄰膜孔中間區域對應典型的脂質分子烴鏈結構；在膜孔正中的高電子密度區被歸屬為高分子刷；環繞高分子刷的一圈次高電子密度的物質被歸屬為磷脂親水端基。傅立葉重建清晰地揭示了親水納米高分子刷選擇性地攻擊細菌細胞膜而成孔的分子原理（圖4c）。這種蜂窩形態的反轉六方結構是膜孔的標志。由于膜孔形成而導致的細菌內環境失衡引發了不可逆的細菌細胞膜碎裂，這也是親水高分子刷殺滅細菌的根因。納米結構在幫助親水高分子刷獲得抗菌活性上起到了決定性的作用，因為只有由納米結構衍生的多價相互作用才能引發細菌細胞膜包裹彎曲在納米結構周圍形成膜孔。失去納米結構的高分子刷酶解產物或者構成刷子的親水高分子本身均不會引起細菌細胞膜的這種拓撲構造的變化，從而也失去了殺菌活性。另外，這種由納米結構引起的細胞膜拓撲構造的變化只適用于細菌而不適用于動物細胞，因為只有細菌細胞膜內含有大量負曲率的脂質分子，它們幫助抵消了把細胞膜沿著納米結構彎曲成孔所需要的自由能。與之相反，因為動物細胞膜的主要成分是零曲率的脂質分子，它們更傾向于形成平直而不是彎曲的膜結構，同樣的成孔機制會因為所需的自由能太大而不可能實現。

  綜上所述，本項工作闡述了一種設計基于納米結構的智能模塊化抗生素的新概念。無毒也無殺菌活性的親水高分子在組裝成納米高分子刷后會變成無毒但有高效殺菌活性的抗生素。這種由“組裝激活”的殺菌特性也會隨納米結構解散而消失。納米結構是“打開”或“關閉”殺菌活性的關鍵。這一發現使開發能響應自然生態環境特有信號（比如纖維素酶）而“解散失活”的環保抗生素變為可能， 從而為減少人造抗生素垃圾造成的生態污染提出了新的解決思路。  

  本研究的相關結果已發表于Biomacromolecules，入選ACS Editors'' Choice，并得到了化學與工程新聞的突出報道（C&EN, 04/14/2020,“Bottle-brush antibiotic busts bacterial membranes”, Vol 98, No. 15）。本項目得到了美國國家科學基金 (NSF DMR-1810767), South Plains基金，及CH基金 的經費支持。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.biomac.0c00163