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  癌癥疫苗通過激活人體自身的免疫系統(tǒng)來消除腫瘤，已經(jīng)成為最有前途的癌癥治療策略之一。然而，目前大多數(shù)已獲許可的疫苗只能誘導CD4+ T細胞介導的體液免疫，而不能誘導CD8+ T細胞調(diào)節(jié)的細胞免疫，對癌癥患者的治療效果有限，臨床效益不理想。熱休克蛋白（HSPs）是生物體內(nèi)最豐富、最普遍的分子伴侶之一，它不僅是復雜蛋白穩(wěn)態(tài)的有效調(diào)節(jié)因子，而且是免疫系統(tǒng)強有力的激活因子。HSPs可以通過其獨特的蛋白結(jié)合域捕獲腫瘤抗原，形成穩(wěn)定的HSP-抗原復合物。隨后，HSP通過與抗原提呈細胞（APCs）表面受體的相互作用被順利內(nèi)化，并通過MHC I和MHC II途徑呈遞抗原，從而激活細胞毒性T細胞(CD8+)和T輔助細胞(CD4+)，發(fā)揮其免疫功能。

  近日，南開大學化學學院史林啟教授團隊聯(lián)合中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所劉鑒峰研究員團隊在國際知名學術(shù)期刊Nano Letters（DOI: 10.1021/acs.nanolett.0c01230）上發(fā)表文章。該研究利用表面修飾甘露糖的混合殼層膠束模擬熱休克蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，構(gòu)建了一種新型的納米分子伴侶（nChap）作為納米疫苗用于激活抗腫瘤免疫反應。nChap的表面由塌縮的pH響應性疏水微區(qū)與伸展的親水聚合物鏈段組成，從而形成類似熱休克蛋白的疏水結(jié)合域和空腔，可以捕獲抗原并通過受體介導作用將其靶向遞送至樹突狀細胞（DCs）。隨后，nChap借助疏水微區(qū)在酸性條件下的質(zhì)子海綿效應破壞溶酶體，從而促進抗原逃逸并增強其在細胞質(zhì)中的交叉遞呈，進而同時誘導基于CD4+和CD8+ T細胞的免疫反應，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的高效殺傷（圖1）。

圖1. 基于納米分子伴侶的癌癥疫苗用于癌癥免疫療法的原理圖。

  研究人員首先以雞卵清蛋白（OVA）為抗原模型，研究nChap對OVA的捕獲能力。動態(tài)光散射（DLS）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移實驗（FRET）結(jié)果均表明nChap通過疏水微區(qū)可成功捕獲OVA形成納米分子伴侶-OVA復合物（nChap@OVA）（圖2b-d）。同時，nChap@OVA在不同pH條件下的粒徑變化以及在體外OVA的累計釋放結(jié)果均顯示nChap具有可逆捕捉/釋放OVA的能力（圖2e-f）。

圖2. (a) nChap@OVA納米疫苗制備示意圖, (b, c) PMs和nChap在不同濃度的OVA下的尺寸分布變化, (d) 熒光共振轉(zhuǎn)移圖, (e) nChap捕獲/釋放OVA后粒徑的分布, (f) nChap@OVA體外累積釋放曲線, (g) PAE鏈的質(zhì)子化/去質(zhì)子化以實現(xiàn)其親水/疏水轉(zhuǎn)化的示意圖

  接下來，研究人員考察了納米分子伴侶疫苗的細胞內(nèi)化，促進抗原溶酶體逃逸以及誘導骨髓源樹突狀細胞（BMDCs）成熟的能力。激光共聚焦和流式細胞術(shù)的結(jié)果表示，甘露糖修飾的納米疫苗可以促進DC細胞對其的攝取（圖3a-c）。進一步共定位實驗發(fā)現(xiàn)，當進入溶酶體酸性環(huán)境后，納米分子伴侶的疏水微區(qū)鏈段會通過質(zhì)子海綿效應促進溶酶體的破裂，從而實現(xiàn)抗原的胞質(zhì)遞送（圖3d-f）。同時，納米分子伴侶疫苗成功激活了BMDCs，上調(diào)了BMDCs表面多種成熟信號（圖3g-j）。

圖3. (a,b,c)細胞攝取的激光共聚焦圖像和流式細胞術(shù)檢測及統(tǒng)計數(shù)據(jù), (d)nChap輔助OVA溶酶體逃逸, (e)皮爾遜相關系數(shù)分析, (f)甘露糖介導nChap@OVA被DC細胞內(nèi)化以及PAE的質(zhì)子海綿效應促進抗原溶酶體逃逸示意圖, (g-j)BMDCs表面成熟信號的表達

  研究人員還考察了納米分子伴侶作為預防性疫苗在小鼠體內(nèi)的抑瘤效果。實驗結(jié)果表明納米伴侶疫苗可有效抑制黑色素瘤的生長并延長了小鼠的生存周期（圖4b-c）。此外，經(jīng)nChap@OVA免疫后的小鼠脾臟中CD8+T細胞的百分比明顯增加，并且當脾細胞被抗原重新刺激之后，OVA特異性的CD8+ T細胞迅速增殖（圖4e-i）。值得注意的是，這些CD8+ T細胞可選擇性的直接殺傷B16F10-OVA黑色素瘤（圖4j）。此外， nChap@OVA組小鼠血清中腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和干擾素-γ (IFN-γ)都明顯上調(diào)（圖4k-l）。以上結(jié)果證明nChap@OVA納米疫苗能誘導強烈的免疫反應，并且特異性地清除腫瘤。

圖4. (a)免疫預防組實驗方案, (b)荷瘤小鼠的平均腫瘤生長曲線, (c)各組小鼠的生存曲線, (d)各組小鼠體重變化, (e, f)免疫后小鼠脾臟中CD8+ T細胞和CD4+ T細胞含量, (g, h)脾臟細胞中T細胞的增殖情況, (i)脾臟細胞中CD3+CD8+CD107+ T細胞的含量, (j)CD8+ T細胞對腫瘤的特異性殺傷能力, (k, l)免疫小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的含量

  除此之外，研究人員進一步評估了基于nChap的納米疫苗與anti-PD-1檢查點阻斷的聯(lián)合治療效果。結(jié)果顯示，單純使用anti-PD-1或nChap@OVA 納米疫苗僅能稍微延緩腫瘤的生長，在28-32天內(nèi)全部小鼠死亡。而聯(lián)合治療能有效抑制腫瘤生長，延長小鼠生存時間至50天以上（圖5 b-c）。究其原因是，納米分子伴侶疫苗可以同時激活CD4+ T細胞和CD8+ T細胞，并促進它們在腫瘤中的積累。而anti-PD-1抗體能有效減少腫瘤細胞對T細胞的耗竭，進一步增強T細胞向腫瘤的浸潤，從而在聯(lián)合免疫治療中實現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤反應（圖5 e-i）。

圖5. (a)針對已建立B16F10-OVA腫瘤的小鼠的免疫治療方案, (b)各組小鼠腫瘤生長曲線, (c)各組小鼠的生存曲線, (d)各組小鼠體重變化曲線, (e-h)各組小鼠腫瘤中CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的數(shù)量以及兩者的比值, (i)腫瘤切片免疫熒光染色

  以上體外/體內(nèi)實驗結(jié)果均表明，這種基于納米分子伴侶的疫苗可以有效地模仿HSPs的結(jié)構(gòu)和功能，實現(xiàn)疏水微區(qū)結(jié)構(gòu)輔助的抗原捕獲、表面受體介導的DCs內(nèi)化以及對體液免疫和細胞免疫的雙重激活，有望為開發(fā)高效的仿生納米疫苗提供新的策略與思路。

  論文的第一作者為南開大學化學學院李雪博士。南開大學化學學院史林啟教授，劉陽研究員和中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所劉鑒峰研究員、黃帆副研究員為論文的共同通訊作者。

  論文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.nanolett.0c01230