牙周炎是一種慢性炎癥性疾病，高發于老齡人群。牙周組織持續發炎會導致支撐結構的嚴重破壞，包括牙槽骨（AB）、牙周膜和牙骨質，最終導致牙齒脫落。主要治療目標包括減輕炎癥和促進功能性牙周組織的再生，其中AB重建是這一過程的關鍵步驟。在臨床實踐中，引導骨再生技術是重建AB的有效方法，涉及利用引導骨再生（GBR）膜以阻止牙齦結締組織的快速生長并阻止其侵入骨缺損。目前現有的GBR膜在牙周炎的治療中缺乏主動免疫調節和足夠的成骨能力，導致治療效果不理想。開發簡單、快速和可編程的制造方法來構建含有特定生物活性成分和微結構的先進GBR薄膜仍然面臨挑戰。
近期，華東理工劉昌勝院士/屈雪教授聯合北大口腔張學慧教授團隊報道了一種鹽效應調控的膠原蛋白電組裝技術，能夠便捷、高效構建出具有精確可調的多孔結構（即孔隙率和孔徑）的膠原薄膜。特別是，諸如抗炎藥物雙氯芬酸鈉（DS）之類的生物活性鹽類也可以調節多孔結構，并同時實現藥物的負載及緩釋。在預編程條件下進行順序電組裝，能夠制造出載DS的致密-多孔Janus復合膜。含有DS的多孔層通過其多孔形態和釋放的DS提供雙重理化信號，協同抑制炎癥并促進成骨。致密層引導纖維組織定向生長，防止其侵入骨缺損區域中。總體而言，這項研究證明了利用電化學沉積技術進行膠原蛋白可編程組裝的巨大潛力，可實現功能定制以適應再生醫學的特定需求。具體成果以 “Programmable Electro-Assembly of Collagen: Constructing Porous Janus Films with Customized Dual Signals for Immunomodulation and Tissue Regeneration in Periodontitis Treatment”發表在《Advanced Science》上。
【材料設計思路、制備及應用】
電組裝是一種新興的增材制造技術，它利用施加的電信號（通常 <5 V）來引導生物聚合物在電極表面或其附近組裝。電組裝的主要優勢包括其簡便性、快速性（通常在幾分鐘內完成）、無需額外試劑，以及可以精確調控組裝材料的微觀結構特征。在先前的研究中，他們通過電信號控制生物大分子在電極表面形成薄膜，進而實現這些組件的微觀結構和宏觀形態的精確構筑。這種精細的分層超分子結構，源于帶電大分子對電信號產生的靜電場響應，以及電化學反應在局部區域產生的高pH值環境下，分子間相互作用的精細調控。此外，離子的靜電屏蔽作用顯著改變了帶電聚合物對靜電場的響應，從而影響了聚合物鏈間的相互作用、聚合物的動力學組裝過程以及聚合物組織的pH依賴性平衡。在這項研究中，他們將電組裝技術應用于膠原蛋白，以制造具有精確多孔拓撲結構的膠原蛋白薄膜，包括特定的孔隙率、孔徑和孔分布。該方法使用具有抗炎特性的離子藥物DS提供靜電屏蔽效應，不僅可以調節膠原薄膜的多孔結構，而且可以被膜負載及緩釋。此外，他們證明了在預設的DS環境條件下，通過順序電組裝技術可以構建具有致密/多孔不對稱結構的Janus多孔薄膜，為牙周炎治療提供了一種材料手段。這種Janus薄膜具有雙重功能：(i) 其致密層可作為引導結締組織成纖維細胞生長的平臺，并防止其侵入骨缺損區；(ii) 其多孔層通過獨特的多孔拓撲結構和DS持續釋放的“分子信號”，表現出免疫調節活性，能抑制巨噬細胞的M1表型，并在炎癥條件下促進M2表型的形成，間接促進牙周炎中成骨細胞的再生，如圖1所示。
圖1. (a) 說明可溶性鹽如何調節膠原蛋白的電組裝及其潛在機制。可溶性鹽解離的陰離子通過靜電相互作用屏蔽溶液中膠原蛋白的正電荷，導致膠原蛋白分子在外加電場下緩慢遷移到陰極，然后在陰極處組裝成松散組織（即高含水量）的水凝膠網絡。陰極表面由于陰極反應產生局部高pH值。 (b) 使用具有預編程離子環境（即鹽種類、濃度）的溶液對膠原蛋白進行連續兩步電組裝，允許定制具有特定多孔微結構（即孔隙率和孔徑）的基于膠原蛋白的 Janus 多孔膜和生物活性鹽組合物(即抗炎藥，DS）賦予炎癥調節的生物功能。 (c) Janus膜的特定微結構和抗炎成分的耦合可以提供不對稱的細胞反應（防止成纖維細胞浸潤，但促進成骨細胞生長和分化）和免疫調節功能，從而抑制炎癥并促進牙周組織再生。
圖2. 離子靜電屏蔽效應對膠原蛋白電組裝和多孔形成的影響。(a) 在不存在和存在可溶性NaCl的情況下膠原蛋白電組裝的圖示。(b) 在沒有NaCl的環境下電組裝的膠原膜（指定為“E-Col”）薄且堅固，而在NaCl存在下電組裝的膜（指定為“E-Col/Cl- ”）更厚更軟（注：電組裝條件為6.67 mA/cm2，1000 s）。(c) SEM圖像顯示，薄膜的孔隙率隨著電解液中可溶性Cl-濃度的增加而增加。(d) 用不同濃度的Cl-制備的薄膜的表面孔徑分布直方圖。(n= 100) (e) 溶解的膠原蛋白分子在不同濃度的Cl-、SO42?和Cit3? 環境下的zeta電位，表明膠原蛋白分子的電荷隨著可溶性鹽濃度的增加而逐漸減小。(n= 3) (f)在不同濃度的鹽存在下膠原膜生長速率的定量測定。(n= 5)。(g)添加高陰離子價鹽可以在冷凍干燥后對電組裝膠原蛋白膜的孔徑和孔隙率進行更廣泛的調節。
圖3. 不同薄膜的體外抗炎功能。(a) 在 E-Janus Col/DS的多孔表面（可緩釋DS）上培養被LPS激活的巨噬細胞（即RAW264.7）的圖示。(b) TCP（即空白組）、E-Janus Col/DS的多孔表面、E-Col/Cl-的多孔表面、E-Col的致密無孔表面上孵育的巨噬細胞的 CD 86 +（M1標記）和 CD206 +（M2 標記）流式結果。(c)不同組中RAW 264.7的M1和M2極化的定量百分比（n= 4）。(d) 在薄膜表面培養24小時后，RAW264.7的促炎和抗炎相關基因表達。這表明E-Janus Col/DS薄膜的多孔表面結構協同緩釋的DS對炎癥降低的效果最為明顯(n= 4)。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p <0.001。所有數據均以平均值±標準差表示。使用單因素方差分析進行比較。
圖4. 不同組薄膜治療牙周炎的體內評價。（“Blank”為無膜植入組，“E-Janus Col/DS”為具有致密/多孔不對稱結構且可緩釋DS的膠原膜，“E-Janus Col/Cl-”為具有致密/多孔不對稱結構的膠原膜，“E-Col”為致密無孔的膠原膜，“BioGide”為臨床常商業膠原膜）(a) 示意圖說明了大鼠牙周炎的誘導和膜植入手術過程。(b) 術后4周和8周牙周組織中相應促炎基因（IL 1β、IL 6和IFN γ）的相對mRNA表達水平。(c) 植入不同薄膜材料后4周和8周時大鼠上頜骨的顯微CT圖像。所有標本均進行歸一化，并校準 Micro-CT 圖像以進行定量比較，并用紅色虛線標記牙槽骨嵴 (ABC) 和牙骨質接合處 (CEJ) 之間的距離。d) 通過在術后 4 周和 8 周后使用 3D 重建體積測量ABC和CEJ之間的距離以及骨礦物質密度來定量確定AB的恢復。(n = 4）。* p < 0.05，** p < 0.01，*** p <0.001。所有數據均以平均值±標準差表示。使用單因素方差分析進行比較。
圖5. 不同薄膜植入牙周缺損后的組織學切片免疫熒光染色。(a) OCN(紅色，成骨細胞標記)、CD86(黃色，M1巨噬細胞標記)、CD206(綠色，M2巨噬細胞標記)的代表性免疫熒光染色圖像。(b)不同材料植入牙周組織4周和8周后陽性染色細胞的半定量。(n=12)，每個隊列中有3個區域，4個切片重復。***p < 0.001。所有數據均以mean±SD表示。采用單因素方差分析進行比較。
本研究突出了利用靜電屏蔽效應對生物聚合物進行電組裝，進而精確控制其生物功能的巨大潛力。電加工技術通過方便的電信號輸入和溫和、可定制的水性反應系統，為創制新型生物材料提供了一種簡潔、快速且高度定制化的方法。重要的是，這種方法為提升傳統生物基材料如膠原蛋白的功能提供了新的視角，從而為生物醫學應用中先進材料的設計與開發開辟了新的路徑。
論文的第一作者為華東理工大學“國家博新計劃”獲得者雷淼博士后，碩士研究生萬浩然，北大口腔宋佳博士和盧妍惠博士為論文共同第一作者。論文第一單位為華東理工大學。該研究工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金，上海市優秀學術帶頭人項目，上海市揚帆計劃及中國博士后科學基金會等項目的資助。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202305756
