近些年來(lái)，隨著RNA上可逆動(dòng)態(tài)化學(xué)修飾的發(fā)現(xiàn)及深入研究，信使RNA不再僅僅作為遺傳信息傳遞的載體，更在各種生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控中起到重要作用，其化學(xué)修飾、結(jié)構(gòu)和功能的研究也由此變得極為重要。RNA標(biāo)記作為其結(jié)構(gòu)、代謝和功能研究的重要手段受到了科研工作者的廣泛關(guān)注。除了N6-甲基腺嘌呤核苷(m6A，當(dāng)前受到化學(xué)家和生物學(xué)家極大的關(guān)注)、假尿苷以及N1-甲基腺嘌呤核苷等RNA中天然存在的化學(xué)修飾，人為設(shè)計(jì)的具有化學(xué)基團(tuán)修飾的核苷衍生物或類(lèi)似物也可以通過(guò)細(xì)胞內(nèi)代謝的作用，參與RNA合成，并借此實(shí)現(xiàn)標(biāo)記的目的，如尿嘧啶的類(lèi)似物4-硫尿苷(4-SU)最為常用。但由于其與尿苷在堿基配對(duì)上表現(xiàn)近乎相同，因此無(wú)法通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-突變測(cè)定方法來(lái)區(qū)分標(biāo)記與未標(biāo)記的RNA。
在該項(xiàng)工作里，浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)系劉建釗研究員課題組設(shè)計(jì)了一種新的帶有烯丙基修飾的N6-烯丙基腺嘌呤核苷(a6A)，通過(guò)細(xì)胞代謝或體外酶輔助的方法可以標(biāo)記體內(nèi)外RNA，利用a6A中N6-烯丙基修飾基團(tuán)的活性，經(jīng)過(guò)連續(xù)的有機(jī)化學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)處理，使得RNAa6A修飾位點(diǎn)在逆轉(zhuǎn)錄成DNA過(guò)程中發(fā)生堿基突變，最后通過(guò)核酸DNA測(cè)序手段識(shí)別標(biāo)記的RNA（如下圖）。
課題組在研究中發(fā)現(xiàn)，a6A與A一樣，可以作為單體通過(guò)人體細(xì)胞代謝引入到新合成的RNA中。另外，課題組還可以利用人體細(xì)胞的RNA甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3/METTL14，通過(guò)將其輔助因子S-甲基腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基改造為烯丙基，即合成帶有烯丙基的酶輔助因子allyl-SAM，以此將烯丙基基團(tuán)修飾到特定RNA序列中A的N6位置上，生成特異性a6A標(biāo)記的RNA。在溫和的條件下，a6A的N6-烯丙基中碳碳雙鍵經(jīng)過(guò)碘加成后可以自發(fā)地誘導(dǎo)生成N1 ,N6-環(huán)化腺嘌呤，由于環(huán)化結(jié)構(gòu)屏蔽了N1 ,N6位置的氫鍵，在逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)cDNA的過(guò)程中相應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生突變（突變成T / C / G），而未修飾烯丙基的A則不會(huì)發(fā)生突變。進(jìn)一步還發(fā)現(xiàn)，RNA中已經(jīng)存在的m6A修飾對(duì)于甲基轉(zhuǎn)移酶輔助的烯丙基標(biāo)記是惰性的，不會(huì)在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)生上述突變效應(yīng)，該結(jié)果為開(kāi)發(fā)全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)RNA單堿基分辨率區(qū)分m6A和A的高通量測(cè)序方法提供了啟示。
RNAa6A的化學(xué)標(biāo)記法將在RNA研究領(lǐng)域具有很多潛在的應(yīng)用，如細(xì)胞新生RNA的測(cè)序與RNA衰變動(dòng)力學(xué)，以及在全轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)識(shí)別m6A位點(diǎn)，并獲取RNA上特定位點(diǎn)m6A修飾的化學(xué)計(jì)量比。同時(shí)，該項(xiàng)工作也為研究者提供了一種新的思路，通過(guò)酶輔助化學(xué)基團(tuán)修飾的方法可用于RNA上定點(diǎn)堿基的標(biāo)記。
該工作主要由浙江大學(xué)高分子科學(xué)與工程學(xué)系劉建釗課題組與芝加哥大學(xué)化學(xué)系的何川教授課題組合作完成，共同第一作者為浙江大學(xué)高分子系博士生舒瀟和芝加哥大學(xué)化學(xué)系Dr. Qing Dai和博士生TongWu，相關(guān)論文“N6-Allyladenosine: A New Small Molecule for RNA Labeling Identified by Mutation Assay”發(fā)表于Journal of the American Chemical Society。該項(xiàng)目得到科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“蛋白質(zhì)機(jī)器與生命過(guò)程調(diào)控”青年項(xiàng)目（2017YFA0506800）、國(guó)家自然科學(xué)基金委（21642015）、國(guó)家青年千人計(jì)劃以及浙江大學(xué)百人計(jì)劃支持。
