2025年3月，中山大學(xué)楊江研究員團(tuán)隊(duì)在《Journal of Controlled Release》上在線發(fā)表了題為《Inhalable pH-responsive charge-reversal polymer-small interfering RNA polyplexes for directed gene therapy of anaplastic lymphoma kinase fusion-positive lung cancer》研究性論文。該研究針對間變性淋巴瘤激酶（ALK）融合陽性非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療挑戰(zhàn)，開發(fā)了一種可吸入的pH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物-siRNA復(fù)合物（PPH）。傳統(tǒng)ALK酪氨酸激酶抑制劑存在耐藥性和副作用問題，而RNA干擾（RNAi）技術(shù)因siRNA遞送效率低和穩(wěn)定性差難以應(yīng)用。研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種由聚乙二醇（PEG）、聚β-氨基酯（PBAE）和組氨酸組成的PPH聚合物，通過靜電作用自組裝形成納米復(fù)合物。該載體在堿性胸膜液中保持負(fù)電荷以保護(hù)siRNA，在腫瘤微酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)為正電荷，促進(jìn)細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸。PPH-siRNA復(fù)合物在體外顯著提高siRNA穩(wěn)定性，在ALK+ NSCLC細(xì)胞（H3122）中，PPH介導(dǎo)的siALK遞送有效抑制ALK表達(dá)，阻斷下游MAPK和PI3K-AKT信號通路，并能顯著抑制原位肺癌異種移植瘤的生長。該研究的創(chuàng)新性地將pH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)機(jī)制與吸入式遞送相結(jié)合，解決了siRNA肺部遞送的關(guān)鍵難題，兼具靶向性、穩(wěn)定性和生物安全性，為RNAi治療ALK+ NSCLC提供了新策略，同時也為其他呼吸系統(tǒng)疾病的核酸藥物遞送開辟了新路徑。這種非病毒載體平臺的技術(shù)突破，有望推動基因治療在臨床中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用。
研究亮點(diǎn)
（1）pH響應(yīng)電荷反轉(zhuǎn)遞送系統(tǒng)：開發(fā)了PPH聚合物，該聚合物在堿性胸膜液中呈陰離子以保護(hù)siRNA，而在酸性腫瘤微環(huán)境中轉(zhuǎn)變?yōu)殛栯x子，增強(qiáng)細(xì)胞攝取和溶酶體逃逸，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控釋。
（2）高效基因沉默與低毒性：通過分子動力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，PPH與siRNA形成穩(wěn)定復(fù)合物，體外轉(zhuǎn)染效率媲美商業(yè)PEI但毒性更低。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，吸入PPH-siALK顯著抑制ALK+肺癌生長（腫瘤抑制率84.5%），并下調(diào)MAPK/PI3K-AKT信號通路。
（3）非侵入性吸入給藥策略：首次實(shí)現(xiàn)siRNA的吸入式遞送，藥代動力學(xué)表明藥物主要富集于肺部，減少全身暴露。呼吸功能測試證實(shí)治療改善肺通氣，且血液學(xué)與組織學(xué)評估顯示優(yōu)異生物安全性，為肺癌靶向治療提供新范式。
圖1. 通過雙正電荷的 PBAE 和 His 增強(qiáng)電荷反轉(zhuǎn)的 PPH-siALK 多聚復(fù)合物的靜電共組裝，實(shí)現(xiàn)針對 ALK+非小細(xì)胞肺癌的 siRNA 指導(dǎo)的吸入式 ALK 基因沉默。
為了應(yīng)對ALK陽性肺癌治療的挑戰(zhàn)，研究人員通過邁克爾加成反應(yīng)將聚β-氨基酯（PBAE）接枝到聚乙二醇（PEG）鏈段，并進(jìn)一步引入組氨酸（His）以增強(qiáng)質(zhì)子緩沖能力。核磁共振氫譜和二維相關(guān)譜驗(yàn)證了合成步驟的完成，特征峰消失表明成功脫保護(hù)。傅里葉變換紅外光譜顯示PBAE和His的特征振動峰，進(jìn)一步確認(rèn)分子結(jié)構(gòu)。凝膠滲透色譜測得不同分子量PPH（2k/5k/10k）的分散指數(shù)在1.36-1.86之間，證明聚合物均一性良好。pH滴定實(shí)驗(yàn)表明PPH具有顯著的質(zhì)子緩沖能力，在酸性條件下（pH~5.0）觸發(fā)電荷反轉(zhuǎn)，透光率測試顯示其pH響應(yīng)性相變行為。該設(shè)計(jì)通過PEG的“隱形”效應(yīng)與PBAE/His的電荷調(diào)控特性，實(shí)現(xiàn)了siRNA在生理環(huán)境中的穩(wěn)定包載及腫瘤微酸環(huán)境下的靶向釋放。
圖2. PPH的化學(xué)合成與表征。
通過TEM和動態(tài)光散射分析發(fā)現(xiàn)，不同分子量（2k/5k/10k）的PPH自組裝形成尺寸均一的納米顆粒。隨著N/P比從10增至40，復(fù)合物表面ζ電位由-15mV逆轉(zhuǎn)為+8mV，在pH5.0時進(jìn)一步升至+12mV，展現(xiàn)顯著pH響應(yīng)性電荷反轉(zhuǎn)特性。電泳遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)PPH2k在N/P≥2時即可完全包裹siRNA，并能有效抵抗RNase I降解，證實(shí)了PPH可以在生理環(huán)境中有效保護(hù)siRNA并能在酸性的腫瘤微環(huán)境中打開并釋放siRNA。
圖3. PPH復(fù)合物的pH響應(yīng)性、電荷反轉(zhuǎn)和核酸酶降解保護(hù)。
分子動力學(xué)模擬顯示，PPH與siRNA的結(jié)合穩(wěn)定性顯著優(yōu)于傳統(tǒng)聚合物PEG-PBAE，PPH-siRNA體系的均方根偏差（RMSD）波動較小，且回旋半徑更小，表明其復(fù)合物結(jié)構(gòu)更緊湊、結(jié)合更牢固（圖4）。通過拉伸分子動力學(xué)（SMD）模擬發(fā)現(xiàn)，PPH脫離siRNA所需外力峰值更高（0.4 ns時達(dá)最大值），且脫離后仍殘留組氨酸與siRNA的相互作用，證實(shí)其結(jié)合模式以鹽橋（磷酸骨架-胺基/咪唑環(huán)）和氫鍵（核堿基）為主。相比之下，PEG-PBAE因缺乏組氨酸的質(zhì)子緩沖能力，與siRNA的靜電和疏水作用較弱，導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性差。該結(jié)果從分子層面揭示了PPH通過雙正電荷模塊增強(qiáng)siRNA負(fù)載效率的機(jī)制，為其高效的pH響應(yīng)釋放提供了理論依據(jù)。
圖4. 聚合物與siALK分子相互作用的分子動力學(xué)模擬。
進(jìn)一步研究了PPH-siRNA復(fù)合物的體外轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)藥代動力學(xué)特性。通過FITC標(biāo)記siRNA的熒光成像和流式定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著N/P比從20升至60，H3122細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率逐步提高，最終確定N/P=40為最優(yōu)配比。共聚焦圖片顯示，PPH-siRNA復(fù)合物在進(jìn)入細(xì)胞后主要定位于溶酶體，但120分鐘后出現(xiàn)顯著的溶酶體逃逸現(xiàn)象，胞質(zhì)內(nèi)熒光呈現(xiàn)彌散分布，證實(shí)其pH響應(yīng)特性可促進(jìn)核酸釋放。藥代動力學(xué)研究顯示，吸入給藥的半衰期與靜脈注射相當(dāng)，但生物分布特征顯著不同：吸入組在肺部呈現(xiàn)特異性累積，而靜脈注射組主要分布于肝臟。兩種給藥途徑的AUC0-48h均達(dá)到90 %ID·h/g以上，表明PPH載體系統(tǒng)通過吸入途徑既能維持系統(tǒng)暴露量，又可實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的肺部靶向遞送，為減少全身毒性提供了重要依據(jù)。
圖5. 復(fù)合物在H3122細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率、藥物動力學(xué)與生物分布。
體外實(shí)驗(yàn)顯示，PPH載體相較于傳統(tǒng)聚乙烯亞胺（PEI）展現(xiàn)出顯著降低的細(xì)胞毒性，同時能高效遞送siRNA實(shí)現(xiàn)靶向ALK基因沉默。該復(fù)合物通過特異性抑制ALK蛋白表達(dá)，有效阻斷下游PI3K/AKT和MAPK/ERK信號通路的活化，從而顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力、克隆形成潛力以及遷移侵襲特性。Western blot分析進(jìn)一步證實(shí)，PPH介導(dǎo)的RNA干擾不僅選擇性降低ALK表達(dá)水平，還對MEK、ERK、AKT等關(guān)鍵信號分子的磷酸化具有顯著抑制作用，揭示了其通過多通路協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的分子機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)為PPH載體在基因治療中的高效性和安全性提供了重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
圖6. PPH2k介導(dǎo)的siRNA定向ALK基因沉默并抑制H3122細(xì)胞的生長。
在小鼠原位肺癌異種移植模型中，通過吸入給藥的PPH-siRNA復(fù)合物能有效靶向肺部腫瘤，顯著抑制ALK+ NSCLC腫瘤的生長并延長荷瘤小鼠生存期（圖7），同時通過系統(tǒng)性肺功能測試證實(shí)其對呼吸參數(shù)無明顯不良影響，未引發(fā)氣道阻塞或炎癥損傷，表明該吸入式基因療法在高效抑制腫瘤的同時具備良好的肺部安全性（圖8）。組織學(xué)分析證實(shí)其通過特異性抑制ALK表達(dá)及下游信號通路發(fā)揮抗腫瘤作用，且未觀察到主要器官的病理損傷，表明該吸入式基因遞送系統(tǒng)兼具靶向性、有效性和生物安全性。
圖7. PPH遞送siALK抑制了H3122肺癌的生長。
圖8. PPH-siALK的治療有效緩解了肺癌模型小鼠的肺功能。
綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)通過設(shè)計(jì)pH響應(yīng)型電荷反轉(zhuǎn)聚合物-siRNA復(fù)合物（PPH）并結(jié)合吸入式遞送策略，為ALK融合陽性非小細(xì)胞肺癌的RNA干擾治療提供了創(chuàng)新性解決方案，尤其在實(shí)現(xiàn)靶向遞送、增強(qiáng)siRNA穩(wěn)定性和克服傳統(tǒng)酪氨酸激酶抑制劑耐藥性方面，展現(xiàn)出了顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2025.113644
通訊作者簡介
邢蔚，中山大學(xué)腫瘤防治中心手術(shù)麻醉科副主任，主任醫(yī)師、博士生導(dǎo)師，美國弗吉尼亞大學(xué)麻醉科訪問學(xué)者，以第一作者和通訊作者在Anesthesiology, British Journal of Anaesthesia等期刊發(fā)表論文30余篇，其中發(fā)表于Anesthesiology的論著成為當(dāng)期封面。
