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香港科技大學唐本忠院士與華南理工大學王迎軍院士、任力教授合作:聚集誘導發光探針用于抗菌肽的作用機制研究
2018-04-13  來源:聚集誘導發光AIE

  抗生素濫用導致的細菌耐藥性已成為當今社會面臨的嚴重威脅,因此亟需發展新型抗菌試劑。相較于抗生素,抗菌肽具有高殺菌活性、廣譜抗菌性、不易產生耐藥性等優點,是當前抗菌領域的研究前沿和熱點。盡管已有多種抗菌肽被報道,但其作用機制尚不完全明確,部分原因是由于SEM、TEM、AFM等常規觀測手段,僅能提供抗菌肽與細菌結合后的靜態信息,難以揭示抗菌肽與細菌結合的動態過程。

  相對于上述靜態成像技術,熒光成像具有成本低、易于操作、可實時原位觀測等優點。由于抗菌肽在殺滅細菌時,通常需要高濃度聚集于細菌的表面或內部,而傳統熒光染料存在聚集猝滅發光(ACQ)的缺陷,難以用于抗菌肽的作用機制研究。此外,傳統熒光染料光穩定性差,難以長期實時監測抗菌肽與細菌的結合過程。因此,發展能夠克服ACQ缺陷,且簡便易得、光穩定性好的熒光探針,實時原位監測抗菌肽與細菌的結合過程,對揭示抗菌肽的作用機制具有重要意義。

  聚集誘導發光(AIE)材料具有聚集態發光效率高、斯托克位移大、生物相容性好、抗光漂白能力強等優點。近日,香港科技大學唐本忠院士團隊與華南理工大學王迎軍院士團隊合作,通過在抗菌肽HHC36(KRWWKWWRR)上修飾AIE分子2-(2-羥基苯基)苯并噻唑(HBT),制備了AIE探針AMP-2HBT(圖1),不僅保持了HHC36多肽的抗菌活性,而且由于其在稀溶液中發光很弱,可通過熒光“點亮”的方式,實時觀測抗菌肽與細菌的結合過程,進一步通過STORM超分辨熒光成像、SEM和TEM成像,有效揭示了抗菌肽HHC36通過破壞細菌膜的結構從而殺滅細菌的機制。

圖1 AIE探針AMP-2HBT的分子結構及其與細菌結合后點亮熒光并殺滅細菌的過程示意圖。

  通過比較抗菌肽HHC36與探針AMP-2HBT的殺菌效率,發現在HHC36多肽上修飾HBT分子,并未影響其殺菌活性(圖2)。例如,在10,20,50,100 μM濃度時,HHC36多肽和AMP-2HBT探針對大腸桿菌的殺滅效率分別為84.25,94.64,99.68,99.84%和87.56,94.33,99.53,99.95%。進一步研究發現,AMP-2HBT探針可迅速抑制細菌的活性,當將20 μM探針加入至細菌溶液(107 CFU mL–1)中時,所有細菌在2 min內即停止運動。

圖2 (A) 不同濃度HHC36多肽及AMP-2HBT探針對大腸桿菌的殺菌效率;(B) 加入AMP-2HBT探針后,大腸桿菌的運動活性隨時間的變化。

  探針AMP-2HBT具有典型的AIE性質,當其在稀溶液中時,由于分子內運動,熒光很弱;當其與細菌結合后,分子內運動受限,發出強熒光(圖3A)。因此探針AMP-2HBT可用于細菌的免洗成像,實時監測抗菌肽與細菌的結合過程。進一步,基于熒光顯微鏡和流式細胞儀分析發現(圖3B-F),隨時間的延長,AMP-2HBT探針與細菌結合的數量逐漸增加,其熒光強度亦逐漸增加,在30,45,60 min時,探針結合至細菌后的平均熒光強度分別為15 min時的2.9,4.6,6倍。

圖3 探針AMP-2HBT實時原位監測與細菌的結合過程:(A)探針AMP-2HBT和大腸桿菌自身,及與大腸桿菌結合后的熒光光譜;(B)–(E)不同時間下細菌的熒光照片;(F)不同時間下流式分析結果。

進一步,通過結合隨機光學重建顯微鏡(STORM)、掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)分析發現,熒光探針AMP-2HBT可有效結合至大腸桿菌的細菌膜上(圖4),通過破壞細菌膜的結構,導致細菌內容物流出,從而有效殺死細菌。

圖4 (A,B) AMP-2HBT結合至大腸桿菌后的STORM超分辨熒光照片;(C,D) 分別為AMP-2HBT與大腸桿菌結合前后的TEM照片;(E,F)分別為AMP-2HBT與大腸桿菌結合前后的SEM照片。

  該工作通過在抗菌肽上修飾AIE分子,在不影響抗菌肽自身活性的前提下,可通過熒光成像實時動態觀測抗菌肽與細菌的結合過程和作用方式,有效克服了傳統熒光染料的聚集猝滅發光缺陷,為抗菌肽的機制研究提供了一種有效的研究工具。

  這一研究成果近期發表在《ACS Applied Materials & Interfaces》上,文章的共同第一作者為華南理工大學陳軍建博士、高蒙副研究員和王琳副研究員,本文的通訊作者為唐本忠院士、王迎軍院士任力教授。

  論文鏈接:https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021%2Facsami.7b18221

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