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  近期，清華大學深圳國際研究生院彌勝利和孫偉課題組在角膜基質誘導再生領域取得重大進展，相關成果于2020年3月18日發表在《自然·通訊》（Nature Communications）期刊上，題為“纖維增強的GelMA水凝膠用于誘導角膜基質的再生（Fiber reinforced GelMA hydrogel to induce the regeneration of corneal stroma）”。

  眼角膜作為視覺成像系統中一個至關重要的組織，是眼睛最前面的凸形高度透明物質，可以保護眼內的微結構及組織，并為眼睛提供大部分屈光力。但是角膜損傷、感染及一些先天性因素導致角膜疾病成為全球第二大致盲疾病。同種異體角膜、人工角膜及人的羊膜移植是三類臨床上應用最廣泛的角膜疾病治療方法，但是這些方法都會存在一定的問題或缺陷。因此，利用先進的生物制造工程的方法（Biofabrication）開發出一種治療性的角膜支架，用于替代受疾病影響的角膜組織或誘導角膜組織自身再生，是至關重要的。目前，角膜組織誘導再生的難點在于角膜基質層，該層組織是角膜的主要組成部分，具有多層正交定向的納米纖維板層組成的復雜結構，利用傳統的生物工程的方法很難真實地模擬基質層的結構。纖維板層之間分布著角膜基質細胞，這種細胞在體外培養及角膜組織損傷時很容易轉化為角膜成纖維細胞及肌成纖維細胞，導致角膜出現瘢痕。因此，制備能夠模擬天然角膜基質結構的支架，同時保持角膜基質細胞的表型，誘導角膜基質的再生，是一個重大的挑戰。

  針對這一難題，彌勝利和孫偉課題組提出了使用近場靜電紡絲技術制備網格狀的亞微米纖維支架，并和水凝膠技術結合，制備了纖維水凝膠復合支架，用于模擬正交定向的角膜基質板層結構和板層之間起連接作用的糖蛋白。課題組提出了一種最優的拓撲結構及化學因子的組合，可以抑制角膜基質細胞的成纖維分化，保持其表型，并最終實現角膜基質的誘導再生。 

圖1：（a）近場靜電紡絲技術制備的具有不同纖維間距的PECL網格狀亞微米纖維支架在不同放大倍數下的SEM圖片；（b）接種在100um網格狀纖維支架上的角膜緣基質干細胞進行細胞骨架及細胞核染色，細胞可以在支架上沿著纖維方向生長；（c）5% GelMA水凝膠內封裝的角膜緣基質干細胞進行活死染色圖片；（d）5% GelMA水凝膠內封裝的角膜緣基質干細胞進行細胞骨架及細胞核染色圖片；（e）纖維水凝膠復合支架的SEM圖片。

  目前近場靜電紡絲技術應用最廣泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料，不利于細胞的粘附，因此該研究利用PEG作為引發劑，合成了PEG和PCL的共聚物PECL，顯著提高了PCL的親水性。課題組首次利用近場靜電紡絲技術成功制備了正交定向的PECL亞微米纖維支架 (圖1a)，角膜緣基質干細胞可以在支架表面黏附并沿著纖維方向鋪展及生長 (圖1b)。

  研究通過將MA修飾到明膠大分子鏈上合成了GelMA，探究出最優的MA修飾度及GelMA濃度，可以使封裝在GelMA水凝膠內的角膜緣基質干細胞保持高的細胞活性(圖1c)并能鋪展開(圖1d)。

  課題組采用模具灌注的方式制備了纖維水凝膠復合支架 (圖1e)，通過研究不同纖維間距的網格狀支架對纖維水凝膠復合支架理化性能的影響，找出了最優的拓撲結構可以使纖維水凝膠在力學性能、透光度和溶脹性方面最接近于天然的角膜組織。研究將角膜緣基質干細胞接種在2D的細胞培養皿、3D的GelMA水凝膠及最優的纖維水凝膠復合支架內，并研究角膜緣基質干細胞在含血清及不含血清的培養基中的分化及角膜基質細胞表型的維持。研究表明，這種最優的纖維水凝膠的拓撲結構及無血清培養基可以抑制角膜基質細胞向成纖維細胞分化。

圖2 大鼠角膜基質內板層移植實驗及評估：（a）5種支架移植后裂隙燈觀察圖片；（b）支架移植后OCT觀察圖片，標尺是1000um；（c）術后不同時間段中央角膜的厚度；（d）術后1個月和3個月免疫熒光染色圖片觀察組織誘導再生情況，標尺是100um；（e）術后1個月和3個月HE染色圖片觀察組織誘導再生情況，標尺是100um。

  最后，研究使用大鼠進行角膜內的板層移植實驗，分別進行了3D GelMA水凝膠、含化學因子3D GelMA、最優纖維水凝膠支架及含化學因子最優纖維水凝膠支架的移植，對照組為自體角膜移植（圖2a）。術后通過OCT、免疫熒光染色及HE染色進行3個月的研究觀察（圖2b-e）發現相比于其他的支架，含化學因子的最優纖維水凝膠支架的移植可以最好地實現角膜基質的誘導再生。

  本論文第一作者為清華-伯克利深圳學院博士生孔彬和清華大學深圳國際研究生院碩士生陳赟及劉睿，論文通訊作者為彌勝利副研究員和孫偉教授。該研究得到了國家重點研發計劃的支持。

  論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-020-14887-9