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  自3D 生物打印首次被報道后，該領域得到迅速發展。相較于傳統的組織工程，3D生物打印具有能夠制造特定結構的優勢，是有望能轉化進入臨床應用的生物制造方法。然而截至目前很少有真正進入臨床試驗的研究，究其原因在于研究3D生物打印的科學家和臨床醫生所關注的點不同，導致無法實現標準統一。如何跨越這道鴻溝，步入臨床應用的通途是3D生物打印領域接下來面臨的挑戰。作為生物打印的主體，生物墨水的角色尤其重要。3D生物打印的臨床轉化與新一代的生物墨水的開發密不可分。對此，弗萊堡大學高分子研究所的Shastrilab對目前3D生物打印技術（擠壓成型式）進行了總結并提出生物墨水開發的五個階段（TRL1-5），生物墨水需要具備的特性和標準化的工具，以期對未來研究3D生物打印的研究者提供一些參考（圖1）。

圖1 生物墨水開發的五個階段以及各階段涉及到的標準化工具

  此前有學者將生物墨水定義為“能夠適用于自動化制造和成型的包含細胞的配方，可包含生物活性成分和生物材料”。這一定義強調了細胞在生物墨水中的重要性。然而在真實的打印中，生物材料本身的作用不可忽視。在構建復雜結構的例子中，細胞的打印幾乎離不開生物材料的支撐。生物材料不僅扮演了傳遞細胞的作用，其本身對細胞和其他生物活性物質的影響更是不容小覷。早在本世紀初年就有學者提出生物材料的指引作用，其給內含細胞提供了機械力、物理、化學和生物信號。因此本文將生物墨水中的介質（生物材料）比喻為空白的畫布，通過后期的控制和改性具有特定的生物學功能和理化特性，比如引入特殊的基團控制其交聯機制，調控內部原有基團的比例而操控硬度，或者接枝生物小分子使其具備特定的生物功能。

  3D生物打印的臨床轉化可以借鑒組織工程的發展歷程，因為二者具有很多相似性。比如二者都涉及生物材料和細胞的應用，都可應用于組織的修復或替代。目前，組織工程領域已經有產品進入臨床應用，但數量不多，其原因也在于當時組織工程在快速發展后并沒有迅速設想到后期應用的涉及的問題，以至于在后期轉化中出現標準化較慢的階段。所幸3D生物打印和除組織工程以外其他的一些領域都有交集，比如3D打印，基因和細胞治療（圖2）。這三個領域目前都有用于臨床的產品，也有相應的管理條例和標準化規則，可以作為未來3D生物打印的轉化的借鑒。作為產品開發前端的科學家，一方面需要了解領域內相關的標準和規定，讓研發對象從“學術可接受”轉化為“臨床可接受”，另一方面需要確保研發的內容能夠在滿足科學和臨床規范的條件下順利進入轉化的生產線。

圖2 3D生物打印與其他已經有進入臨床應用的技術（組織工程，3D打印以及基因和細胞治療）的交集

  生物打印的結構轉化為存活的組織，需要具備以下特點：在體外培養時保持其結構穩定，能夠適應手術移植過程中的各種操作，在相應的移植部位存活足夠的時間。這些特征可總結為“3P特征”，即可預測的物理特性（predictable physical properties），可預測的生物反應（predictable biological response）和可預測的體內結果（and predictable in vivo outcomes）。為此，生物墨水不僅需要具有適合打印的理化性能，還需要具備促使組織再生的特性，能夠確保打印的結構穩定且能夠再移植后仍然保持活性和特定的生物功能，并且最終能夠轉化為具有功能的體內組織。

  在生物制造過程中，生物墨水首先需要滿足一定的溫度特性。由于生物打印大多涉及打印細胞和生物活性分子，這些內容對溫度要求比較苛刻。通常認為最優的打印溫度為人類生理溫度。一般過高的溫度不作推薦，原因在于高于生理溫度的條件下會引起細胞活動的異常，如細胞內鈣和鈉離子的升高，線粒體膜電位的升高，或活性氧簇水平的升高，這些都會導致細胞損傷或細胞死亡。在40℃時，細胞核可能發生變化；而更高的溫度（41℃）則可能在數分鐘內直接導致細胞的死亡。低于生理溫度的打印此前也有報道，但該溫度不能過低，因為過低的溫度也會導致細胞凍傷和裂解。因此，推薦的打印溫度應該介于室溫（細胞培養操作時的溫度）與生理溫度之間。

  另外生物墨水還要達到醫療使用級別，這意味生物墨水需要無菌且沒有病原體。因此在材料的選擇上和化學制備中需要建立執行標準。材料本身是否含有病原體，化學合成的副產物和分解產物的水平都需要進行規定和測量。在一些聚合物反應中，如果有較多的單體或未反應的催化劑的遺留，勢必對細胞產生毒性。如何對生物墨水滅菌則是另一個難點。目前FDA批準的標準滅菌方法為0.22μm濾器過濾滅菌，高溫高壓滅菌和環氧乙烷滅菌。此前已有報道對這些方法進行了比較，其結果顯示高溫高壓滅菌會破壞聚合物的化學結構，可能引起其性能的改變。而0.22μm濾器過濾只適合于粘度較低的液體，因此應用有限。環氧乙烷可能是更安全而不引起物質特性改變的方法。

  打印本身可以分解為三個過程：1.生物墨水從口徑較小的管道中擠壓出；2.瞬時的結構穩定；3.長期的結構穩定。因此要滿足3D生物打印的制造要求，生物墨水還需要具有剪切變稀，可控的膠化，對結構的保真度和高穩定度以實現上訴三個過程的順暢連接。文中以表格形式列舉了近五年來3D生物打印領域的研究成果，羅列了打印所用的材料，打印的結構，是否為無支撐打印，采用的交聯方式等。

  生物墨水不僅要滿足制造的需求，也需要滿足生物性能的需求，從而達到組織再生。在組織再生過程中，免疫調控和血管化至關重要。現有證據表明，固有免疫和獲得性免疫都在組織再生的過程中有重要的作用。例如在固有免疫中巨噬細胞的極化是免疫調控的重要過程，通常M1型巨噬細胞提供了炎癥前的重要信息，而M2型巨噬細胞則與修復和再生有關。此外，組織再生還涉及調控型T細胞，其分泌的白介素參與到與再生相關的免疫抑制活動中。實現器官型的血管化則是組織再生的另一難點。而血管化本身也和免疫調控藕連。如何實現二者的平衡以維持組織穩態是未來面臨的挑戰（圖3）。

圖3 生物修復過程所涉及的免疫調控

  因此選擇合適的生物墨水的材料實現多種需求尤為關鍵。一直以來生物活性材料被認為良好的選擇，因為它們具有更接近正常組織的成分，有較好的細胞親和力。但活性材料也存在一些劣勢，例如較差的可加工性，更有可能引起不良的排異和免疫反應，無法控制的降解速率等等。而生物惰性材料由于不具備細胞粘附性和降解速度慢一直門可羅雀。實際上，生物惰性材料的優勢在于來源充足，獲取廉價，可成型性好以及可修飾。文中列舉了本實驗室研發的羧基化瓊脂糖生物材料，該材料不僅可以通過羧基化程度來調控成膠的硬度，還能接枝如RGD的小分子來提高細胞粘附力，并且體內實驗證明該材料能穩定存在，未引起強烈的免疫反應，同時允許宿主細胞的進入。

圖4 以羧基化瓊脂糖為例的生物惰性材料的開發過程

  針對上述提出的生物墨水需滿足的特性，文章最后提出三種開發性工具套件用于各階段研究的標準化。它們分別是流變學檢測，交聯策略（TRL1-2）和可用于體內外研究的生物技術（TRL3-4）。流變學檢測可以提供充分的證據以支持生物墨水具有良好的可打印性能。這些檢測應當在確定了滅菌方法后進行以確保獲得的數據為滅菌后材料的特性，同時這些檢測的設計應盡可能模擬打印的條件而能真實反映生物墨水在加工過程中經歷的變化。不僅如此，已有研究發現細胞的占比對生物墨水的流變學性能有影響。大量的細胞占會阻礙分子的交聯，改變成膠的硬度。在涉及高濃度細胞打印的研究中，對含有細胞的生物墨水進行檢測不可或缺。選用交聯機制并制定最優交聯策略不僅能減少打印過程對細胞的損害，還能提高產能。隨著新的聚合物的研發，打印硬件的升級以及高效的交聯劑的應用，交聯過程并非一成不變。實時交聯，多重交聯機制的聯合應用都能讓交聯變得高效而副作用降低。最后，打印的結構能形成具有特定功能的組織還有待于體外培養和體內培育的結果。在過往的很多研究中，3D生物打印的生物實驗往往浮于表面，真正能推進3D生物打印前進的是更加嚴格和系統的生物實驗。被打印的細胞能否維持其表型，能否分化成成熟的組織都需要更深入的研究。已經有越來越多的研究表明細胞可以通過精密的力學傳導器感受外部環境的力學變化從而引起細胞核內的變化。打印過程和生物材料的機械性能都能對細胞產生影響，這些影響是否會改變細胞功能的表達有待揭示。事實上很多實驗方法在生物醫學上的應用已經很成熟，而在3D生物打印中則并不多見；此外隨著表觀遺傳學和高通量測序的普及，這些檢測手段也變得更容易。在未來的研究中，這些研究方法都是3D生物打印的結構能進一步發展的重要基石。

  弗萊堡大學博士研究生顧亞偉為本文第一作者，弗萊堡大學講師Aurelien Forget博士為第二作者，Prasad Shastri教授為本文通訊作者。

作者團隊簡介：

  Prasad Shastri教授目前就職于德國弗萊堡大學高分子研究所，兼弗萊堡大學生物信號研究中心教授。Shastri教授1995年在倫斯勒理工學院獲博士學位，隨后在Robert Langer教授實驗室做博士后研究。此后長期致力于材料科學、修復醫學和腫瘤生物學的研究。目前實驗室的工作重心為生物材料調控細胞微環境，體內組織工程修復，腫瘤生物學，細胞治療和納米生物材料。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202103469