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  自3D 生物打印首次被報道后，該領(lǐng)域得到迅速發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的組織工程，3D生物打印具有能夠制造特定結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，是有望能轉(zhuǎn)化進入臨床應(yīng)用的生物制造方法。然而截至目前很少有真正進入臨床試驗的研究，究其原因在于研究3D生物打印的科學家和臨床醫(yī)生所關(guān)注的點不同，導(dǎo)致無法實現(xiàn)標準統(tǒng)一。如何跨越這道鴻溝，步入臨床應(yīng)用的通途是3D生物打印領(lǐng)域接下來面臨的挑戰(zhàn)。作為生物打印的主體，生物墨水的角色尤其重要。3D生物打印的臨床轉(zhuǎn)化與新一代的生物墨水的開發(fā)密不可分。對此，弗萊堡大學高分子研究所的Shastrilab對目前3D生物打印技術(shù)（擠壓成型式）進行了總結(jié)并提出生物墨水開發(fā)的五個階段（TRL1-5），生物墨水需要具備的特性和標準化的工具，以期對未來研究3D生物打印的研究者提供一些參考（圖1）。

圖1 生物墨水開發(fā)的五個階段以及各階段涉及到的標準化工具

  此前有學者將生物墨水定義為“能夠適用于自動化制造和成型的包含細胞的配方，可包含生物活性成分和生物材料”。這一定義強調(diào)了細胞在生物墨水中的重要性。然而在真實的打印中，生物材料本身的作用不可忽視。在構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)的例子中，細胞的打印幾乎離不開生物材料的支撐。生物材料不僅扮演了傳遞細胞的作用，其本身對細胞和其他生物活性物質(zhì)的影響更是不容小覷。早在本世紀初年就有學者提出生物材料的指引作用，其給內(nèi)含細胞提供了機械力、物理、化學和生物信號。因此本文將生物墨水中的介質(zhì)（生物材料）比喻為空白的畫布，通過后期的控制和改性具有特定的生物學功能和理化特性，比如引入特殊的基團控制其交聯(lián)機制，調(diào)控內(nèi)部原有基團的比例而操控硬度，或者接枝生物小分子使其具備特定的生物功能。

  3D生物打印的臨床轉(zhuǎn)化可以借鑒組織工程的發(fā)展歷程，因為二者具有很多相似性。比如二者都涉及生物材料和細胞的應(yīng)用，都可應(yīng)用于組織的修復(fù)或替代。目前，組織工程領(lǐng)域已經(jīng)有產(chǎn)品進入臨床應(yīng)用，但數(shù)量不多，其原因也在于當時組織工程在快速發(fā)展后并沒有迅速設(shè)想到后期應(yīng)用的涉及的問題，以至于在后期轉(zhuǎn)化中出現(xiàn)標準化較慢的階段。所幸3D生物打印和除組織工程以外其他的一些領(lǐng)域都有交集，比如3D打印，基因和細胞治療（圖2）。這三個領(lǐng)域目前都有用于臨床的產(chǎn)品，也有相應(yīng)的管理條例和標準化規(guī)則，可以作為未來3D生物打印的轉(zhuǎn)化的借鑒。作為產(chǎn)品開發(fā)前端的科學家，一方面需要了解領(lǐng)域內(nèi)相關(guān)的標準和規(guī)定，讓研發(fā)對象從“學術(shù)可接受”轉(zhuǎn)化為“臨床可接受”，另一方面需要確保研發(fā)的內(nèi)容能夠在滿足科學和臨床規(guī)范的條件下順利進入轉(zhuǎn)化的生產(chǎn)線。

圖2 3D生物打印與其他已經(jīng)有進入臨床應(yīng)用的技術(shù)（組織工程，3D打印以及基因和細胞治療）的交集

  生物打印的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為存活的組織，需要具備以下特點：在體外培養(yǎng)時保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠適應(yīng)手術(shù)移植過程中的各種操作，在相應(yīng)的移植部位存活足夠的時間。這些特征可總結(jié)為“3P特征”，即可預(yù)測的物理特性（predictable physical properties），可預(yù)測的生物反應(yīng)（predictable biological response）和可預(yù)測的體內(nèi)結(jié)果（and predictable in vivo outcomes）。為此，生物墨水不僅需要具有適合打印的理化性能，還需要具備促使組織再生的特性，能夠確保打印的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且能夠再移植后仍然保持活性和特定的生物功能，并且最終能夠轉(zhuǎn)化為具有功能的體內(nèi)組織。

  在生物制造過程中，生物墨水首先需要滿足一定的溫度特性。由于生物打印大多涉及打印細胞和生物活性分子，這些內(nèi)容對溫度要求比較苛刻。通常認為最優(yōu)的打印溫度為人類生理溫度。一般過高的溫度不作推薦，原因在于高于生理溫度的條件下會引起細胞活動的異常，如細胞內(nèi)鈣和鈉離子的升高，線粒體膜電位的升高，或活性氧簇水平的升高，這些都會導(dǎo)致細胞損傷或細胞死亡。在40℃時，細胞核可能發(fā)生變化；而更高的溫度（41℃）則可能在數(shù)分鐘內(nèi)直接導(dǎo)致細胞的死亡。低于生理溫度的打印此前也有報道，但該溫度不能過低，因為過低的溫度也會導(dǎo)致細胞凍傷和裂解。因此，推薦的打印溫度應(yīng)該介于室溫（細胞培養(yǎng)操作時的溫度）與生理溫度之間。

  另外生物墨水還要達到醫(yī)療使用級別，這意味生物墨水需要無菌且沒有病原體。因此在材料的選擇上和化學制備中需要建立執(zhí)行標準。材料本身是否含有病原體，化學合成的副產(chǎn)物和分解產(chǎn)物的水平都需要進行規(guī)定和測量。在一些聚合物反應(yīng)中，如果有較多的單體或未反應(yīng)的催化劑的遺留，勢必對細胞產(chǎn)生毒性。如何對生物墨水滅菌則是另一個難點。目前FDA批準的標準滅菌方法為0.22μm濾器過濾滅菌，高溫高壓滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌。此前已有報道對這些方法進行了比較，其結(jié)果顯示高溫高壓滅菌會破壞聚合物的化學結(jié)構(gòu)，可能引起其性能的改變。而0.22μm濾器過濾只適合于粘度較低的液體，因此應(yīng)用有限。環(huán)氧乙烷可能是更安全而不引起物質(zhì)特性改變的方法。

  打印本身可以分解為三個過程：1.生物墨水從口徑較小的管道中擠壓出；2.瞬時的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；3.長期的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此要滿足3D生物打印的制造要求，生物墨水還需要具有剪切變稀，可控的膠化，對結(jié)構(gòu)的保真度和高穩(wěn)定度以實現(xiàn)上訴三個過程的順暢連接。文中以表格形式列舉了近五年來3D生物打印領(lǐng)域的研究成果，羅列了打印所用的材料，打印的結(jié)構(gòu)，是否為無支撐打印，采用的交聯(lián)方式等。

  生物墨水不僅要滿足制造的需求，也需要滿足生物性能的需求，從而達到組織再生。在組織再生過程中，免疫調(diào)控和血管化至關(guān)重要。現(xiàn)有證據(jù)表明，固有免疫和獲得性免疫都在組織再生的過程中有重要的作用。例如在固有免疫中巨噬細胞的極化是免疫調(diào)控的重要過程，通常M1型巨噬細胞提供了炎癥前的重要信息，而M2型巨噬細胞則與修復(fù)和再生有關(guān)。此外，組織再生還涉及調(diào)控型T細胞，其分泌的白介素參與到與再生相關(guān)的免疫抑制活動中。實現(xiàn)器官型的血管化則是組織再生的另一難點。而血管化本身也和免疫調(diào)控藕連。如何實現(xiàn)二者的平衡以維持組織穩(wěn)態(tài)是未來面臨的挑戰(zhàn)（圖3）。

圖3 生物修復(fù)過程所涉及的免疫調(diào)控

  因此選擇合適的生物墨水的材料實現(xiàn)多種需求尤為關(guān)鍵。一直以來生物活性材料被認為良好的選擇，因為它們具有更接近正常組織的成分，有較好的細胞親和力。但活性材料也存在一些劣勢，例如較差的可加工性，更有可能引起不良的排異和免疫反應(yīng)，無法控制的降解速率等等。而生物惰性材料由于不具備細胞粘附性和降解速度慢一直門可羅雀。實際上，生物惰性材料的優(yōu)勢在于來源充足，獲取廉價，可成型性好以及可修飾。文中列舉了本實驗室研發(fā)的羧基化瓊脂糖生物材料，該材料不僅可以通過羧基化程度來調(diào)控成膠的硬度，還能接枝如RGD的小分子來提高細胞粘附力，并且體內(nèi)實驗證明該材料能穩(wěn)定存在，未引起強烈的免疫反應(yīng)，同時允許宿主細胞的進入。

圖4 以羧基化瓊脂糖為例的生物惰性材料的開發(fā)過程

  針對上述提出的生物墨水需滿足的特性，文章最后提出三種開發(fā)性工具套件用于各階段研究的標準化。它們分別是流變學檢測，交聯(lián)策略（TRL1-2）和可用于體內(nèi)外研究的生物技術(shù)（TRL3-4）。流變學檢測可以提供充分的證據(jù)以支持生物墨水具有良好的可打印性能。這些檢測應(yīng)當在確定了滅菌方法后進行以確保獲得的數(shù)據(jù)為滅菌后材料的特性，同時這些檢測的設(shè)計應(yīng)盡可能模擬打印的條件而能真實反映生物墨水在加工過程中經(jīng)歷的變化。不僅如此，已有研究發(fā)現(xiàn)細胞的占比對生物墨水的流變學性能有影響。大量的細胞占會阻礙分子的交聯(lián)，改變成膠的硬度。在涉及高濃度細胞打印的研究中，對含有細胞的生物墨水進行檢測不可或缺。選用交聯(lián)機制并制定最優(yōu)交聯(lián)策略不僅能減少打印過程對細胞的損害，還能提高產(chǎn)能。隨著新的聚合物的研發(fā)，打印硬件的升級以及高效的交聯(lián)劑的應(yīng)用，交聯(lián)過程并非一成不變。實時交聯(lián)，多重交聯(lián)機制的聯(lián)合應(yīng)用都能讓交聯(lián)變得高效而副作用降低。最后，打印的結(jié)構(gòu)能形成具有特定功能的組織還有待于體外培養(yǎng)和體內(nèi)培育的結(jié)果。在過往的很多研究中，3D生物打印的生物實驗往往浮于表面，真正能推進3D生物打印前進的是更加嚴格和系統(tǒng)的生物實驗。被打印的細胞能否維持其表型，能否分化成成熟的組織都需要更深入的研究。已經(jīng)有越來越多的研究表明細胞可以通過精密的力學傳導(dǎo)器感受外部環(huán)境的力學變化從而引起細胞核內(nèi)的變化。打印過程和生物材料的機械性能都能對細胞產(chǎn)生影響，這些影響是否會改變細胞功能的表達有待揭示。事實上很多實驗方法在生物醫(yī)學上的應(yīng)用已經(jīng)很成熟，而在3D生物打印中則并不多見；此外隨著表觀遺傳學和高通量測序的普及，這些檢測手段也變得更容易。在未來的研究中，這些研究方法都是3D生物打印的結(jié)構(gòu)能進一步發(fā)展的重要基石。

  弗萊堡大學博士研究生顧亞偉為本文第一作者，弗萊堡大學講師Aurelien Forget博士為第二作者，Prasad Shastri教授為本文通訊作者。

作者團隊簡介：

  Prasad Shastri教授目前就職于德國弗萊堡大學高分子研究所，兼弗萊堡大學生物信號研究中心教授。Shastri教授1995年在倫斯勒理工學院獲博士學位，隨后在Robert Langer教授實驗室做博士后研究。此后長期致力于材料科學、修復(fù)醫(yī)學和腫瘤生物學的研究。目前實驗室的工作重心為生物材料調(diào)控細胞微環(huán)境，體內(nèi)組織工程修復(fù)，腫瘤生物學，細胞治療和納米生物材料。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202103469