骨骼肌通過肌腱附著在人體的骨骼上，并產生身體各個部位的運動，比如走路和呼吸。骨骼肌的功能可能會受到肌肉疾病和神經肌肉疾病的影響，例如杜氏肌營養不良癥和肌萎縮側索硬化癥。目前科學家們使用實驗室人工培養的骨骼肌細胞來研究這些疾病的病理，并培養相關疾病模型用于新藥設計篩選。然而骨骼肌組織由于其復雜的結構和高強度的收縮性質，在細胞培養皿中是很難完全復制培養的。在人體中，肌纖維的骨骼肌細胞是被細胞外基質支撐包圍著， 并引導人體內骨骼肌組織結構的排列、生長和功能。如果沒有類似的支撐結構，實驗室培養的肌肉是無法達到研究肌肉疾病所需的更接近人體的肌肉。目前文獻報道的肌肉培養方法還受限于復雜耗時的高成本制造步驟和測試方法。
近日，倫敦大學學院外科重建與再生生物材料中心主任宋文輝教授和倫敦國王學院基因治療和再生醫學中心Lieberam 教授在《Advanced Materials》期刊上發表了題為” Biobased Elastomer Nanofibers Guide Light-controlled Human iPSC-derived Skeletal Myofibers”( DIO：10.1002/adma.202110441) 。為了解決這個問題，兩個團隊結合在生物高分子材料和干細胞技術的專長，合作開發了一種新型生物基高彈性納米纖維生物材料支架和便捷靈敏的骨骼肌纖維培養多孔板盤， 利用光基因控制的人類誘導多功能干細胞（iPSC）在納米纖維支架上衍生出更接近人體的骨骼肌纖維，證實了納米纖維支架有助于實驗室培養的骨骼肌組織的生長和穩定。
實驗先設計合成了生物基聚氨酯彈性體，其納米纖維是使用靜電紡絲技術制成， 并通過附加電場來引導納米纖維排列取向。 該納米混雜彈性材料具有優異的高彈性，其斷裂應變高達1000%，彈性模量（~25kPa）在人體骨骼肌的（~11-50kPa）模量范圍內。 匹配的高彈性特性及像細胞外基質形貌的納米纖維結構使其成為支撐肌纖維細胞生長和收縮的理想支架。肌纖維細胞是從人類iPSC干細胞分化衍生出來的。iPSC干細胞是一種由成人皮膚細胞經轉入轉錄因子等技術脫分化形成的多能干細胞, 這類干細胞具有類似胚胎干細胞那樣的再生能力，理論上可以分化為成體的所有器官和組織。 這些干細胞經過光基因工程處理， 使其分化衍生的肌纖維細胞對光響應。這使得我們能夠通過光波信號控制肌纖維收縮，并在自制的懸浮彈性納米纖維多孔板盤培養皿中研究肌肉收縮功能。實驗結果證明，單軸排列取向的彈性納米纖維能引導成肌纖維細胞定向生長， 促進和加強肌細胞纖維的生成。藍光刺激時，彈性納米纖維引導的骨骼肌纖維的收縮速度和收縮力分別高于是傳統培養方法的200% 和280%， 其收縮能量密度為~35 W/m3 , 也在人體骨骼肌的收縮能量密度范圍類。
彈性納米纖維支架孔板盤適用于各種通用型和高通量的測試和圖像分析表征方法， 可以同時進行大量樣品試驗。這將為肌肉和神經肌肉疾病建模，病理研究和治療肌肉疾病的新藥物篩選提供便捷的技術平臺。另外，生物基聚氨酯彈性體具有很好的生物相容性和生物降解性，有望用于組織工程支架促進生成代替肌肉組織治療骨骼肌損傷患者。
圖1. (a) 電紡納米纖維支架引導光基因控制的人類誘導多功能干細胞（iPSC）衍生骨骼肌纖維生長示意圖；(b) 生物基聚氨酯彈性體分子結構
圖2聚氨酯彈性體,P(EDS)UU-POSS, 納米纖維的結構和性能。(a) EDS 多元醇、POSS 納米結構、P(EDS)U-POSS 聚合物及其納米纖維的紅外光譜（FTIR）； (b) 隨機取向和單軸取向的納米纖維的偏振FTIR 光譜。紅外線束在平行于（0°）和垂直于（90°）排列的纖維方向上進行偏振；(c) 隨機取向和單軸排列的納米纖維的掃描電子顯微鏡（ SEM）形貌圖像；(d) 從SEM 圖像測量的納米纖維直徑分布； (e) 快速傅里葉變換(FFT)分析 SEM 圖像測量和擬合纖維取向分布；(f) 納米纖維結構的高度和相位的原子力顯微鏡（ AFM）圖像；(g) 和（h）隨機和 取向的納米纖維支架的拉伸斷裂面SEM 圖像。(i) 拉伸應力- 應變曲線；(j) 不同應變區的熵彈性模量；(k) 聚合物澆鑄固體、隨機取向和單軸對齊納米纖維支架的拉伸強度、韌性和斷裂應變。
圖3. 肌纖維細胞在彈性納米纖維支架上的形態和分化的熒光顯微鏡圖像。藍色代表細胞核DNA；綠色代表肌肉細胞中表達的F-肌動蛋白。C2C12 肌細胞在（a）玻璃蓋玻片（對照）;（b）隨機定向 和（c）單項排列的彈性納米纖維上第 1、5 和 10 天的生長分化成肌管；(d) 快速傅里葉變換（FFT）分析肌纖維細胞和肌管的方向性。(e)和（f） 第 10 天肌管長度和寬度的頻率分布。(g) 第 10 天肌管融合指數（MFI）和（h）肌管成熟指數（MMI）。比例尺100μm。
圖 4. 單軸取向的懸浮納米纖維支架（SNFs）的組裝。(1) 直徑 6.96 毫米的微孔從 2 毫米厚的涂有雙面膠的亞克力板上切割下來。(2) 單個微孔被放置在兩個帶電的電極之間， 膠面朝上。對齊的納米纖維被電紡在微孔上。(3) 微孔和納米纖維懸浮在一側，被倒置，并固定在一個 35 毫米的組織培養皿的底部。膠帶的作用是將納米纖維固定在微孔的邊緣，同時允許將微孔固定在培養皿上。(4) 對組裝好的微孔進行空氣等離子體處理和紫外線消毒，以去除表面污染。(5) 在細胞播種前，用 GFR-Matrigel 預涂 SNFs。在濃縮的（30k 細胞/100ul）培養基中，將成肌祖細胞直接播種到中心孔中。5 分鐘后，一旦細胞明顯沉淀到孔底，就在組織培養皿中加入 1.5ml 的培養基。
圖 5. 光基因控制人類 iPSC 衍生的肌纖維。(a) 第 0-21 天從人類iPSCs 到成肌細胞祖細胞誘導分化（progenitor differentiation [pd]，day 0pd-21pd ）；第0-8天從祖細胞到肌管分化（myotube differentiation [md]， day 0md-8md），以及第8-20天肌管成熟為肌纖維 (day 8md-20md)；(b) 表達 PAX7、MYOD1 和 MYOG 的成肌細胞祖細胞（day 21pd）和肌管（day 8md）的熒光（ICC）圖像分析；(c) 第 10 天肌管（day 10md）紋狀肉質Titin(TTN)的表達；(d) 第 10 天 肌管（day 10md）中轉基因 ChR2-YFP 的表達。
圖 6. 懸浮納米纖維引導人類 iPSC 衍生的肌纖維的光遺傳控制收縮。(a) 在組織培養（TC）塑料（對照）和懸浮納米纖維支架（SNFs）上培養的人類 iPSC 衍生的肌纖維的顯微鏡白場圖像；(b) 第 14 天培養物的 3D 和 2D 肌纖維細胞的 F-肌動蛋白和肌原蛋白（MYOG）免疫熒光圖像；(c) 粒子圖像測速儀（PIV）分析光遺傳控制的收縮位移矢量圖和收縮速度分布熱圖；(d) 第 20 天對照組和 納米纖維支架上的肌纖維收縮的PIV 視頻中得到的肌纖維收縮速度（CV）軌跡。圖中的藍色區域表示 470nm 光開啟的 0.5s 時間窗口。平均值±標準偏差；(e) 第 8 天到第 20 天的對照組和 取向納米纖維支架上的肌纖維的面積平均收縮速度(μm/s)；（f）比收縮力（kN/m2 ) 和 (g) 能量密度（ W m-3 )；(h) 第 20 天的 收縮速度和比收縮力相對于對照組的百分比差異；(i) SNFs 上培養的肌纖維的掃描電子顯微鏡（ SEM）圖像。
論文第一作者是博士生 Aimee Cheesbrough。通訊作者為宋文輝教授和Lieberam 教授。此研究得到BBSRC 倫敦跨學科博士 ( LIDo )培訓計劃， EPSRC和 MRC基金及 Wellcome Trust慈善基金等支持。
原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202110441
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