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福州大學楊建民、石賢愛課題組 Acta Biomater.：具有細菌原位檢測與清除功能的智能傷口敷料

2023-12-18 來源：高分子科技

感染會阻礙傷口愈合過程，甚至可能導致危及生命的并發癥，如組織壞死、器官衰竭和敗血癥。因此，早期及時發現和治療感染性病原體對于防止傷口進一步惡化至關重要，并有利于傷口護理。目前，臨床檢測病原體的金標準主要包括平板培養、聚合酶鏈反應(PCR)、測序等。雖然這些方法相對靈敏可靠，但復雜的工作流程，包括繁瑣的樣品預處理和數小時至數天的檢測時間，可能會錯過治療機會。此外，這些檢測方法的應用受到對精密儀器和熟練操作人員需求的限制，使其難以在醫療資源有限的地區或在現場實施。因此，迫切需要開發簡單、快速、經濟、可現場操作的傷口感染性病原體檢測分析策略。當前，無需實驗室設施的即時檢測(POCT)方法已經成為一種可行的替代方法，也是病原體檢測研究的焦點。雖然POCT方法在檢測傷口細菌方面卓有成效，但它們通常沒有考慮到傷口護理的其他重要方面，如傷口保護、抗菌特性和促進愈合。此外，以往主要基于傷口溫度、pH變化判定傷口感染程度的方式，其準確性往往受環境和生理干擾因素較大。

近日，福州大學生物科學與工程學院楊建民、石賢愛課題組，將即時檢測(POCT)策略和光動力抗菌(PDT)技術相結合構建了一種新型智能敷料，用于原位檢測和清除傷口致病菌。該研究以羧甲基殼聚糖和氧化海藻酸鈉為基質，加入4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷(MUG)和二氧化鈦包覆的上轉化納米顆粒(UCNPs@TiO₂)制備智能水凝膠敷料。該敷料能夠與細菌分泌的β-葡萄糖醛酸酶(β-GUS)反應生成4-MU，后者在紫外光激發下發出裸眼可見的藍色熒光，從而實現對細菌進行可視化檢測。合成的UCNPs@TiO₂光敏劑，能夠在近紅外光照射下生成活性氧(ROS)，從而具有較高的PDT抗菌性能。同時，能夠根據細菌檢測的診斷結果，調整近紅外光照射的時間和頻率。此外，構建了一套基于智能手機的便攜式檢測系統，并配備了自主開發的Android APP，可在幾秒鐘內對病原體進行原位檢測。該研究采用大腸桿菌—金黃色葡萄球菌混合菌液構建SD大鼠全層皮膚創面感染模型，系統評價了智能傷口敷料的體內抗菌活性和促愈合能力。

圖1. 智能傷口敷料示意圖。(a) 智能傷口敷料結構。(b) 同時原位檢測和清除傷口部位的致病菌。(c) 紫外光下細菌原位可視化檢測機制。(d) 近紅外光下抗菌機理。

已知MUG分子含有糖苷鍵，可被β-GUS酶解成4-MU和β-D-葡萄糖醛酸，而4-MU在紫外光照射下可產生藍色熒光。由于常見的傷口病原菌，如大多數腸桿菌科、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌都能分泌β-GUS，因此將MUG摻入透明度較高的水凝膠敷料中可以實現傷口細菌的原位可視化檢測。該研究分別通過肉眼和智能手機檢測裝置觀察水凝膠敷料—大腸桿菌共孵育后藍色熒光強度變化。結果表明，在相同的培養時間下，熒光強度隨細菌濃度的增加而增加，表明可以實現細菌的可視化檢測與感染程度判定。但與基于智能手機的檢測裝置相比，裸眼識別的靈敏度較低。只有當細菌濃度高于10⁶ CFU/mL時，可以裸眼觀察到顯著熒光強度差異；而在智能手機檢測裝置中，細菌濃度為10³ CFU/mL即可觀測到顯著熒光變化。同時，ImageJ處理結果顯示出了類似的變化趨勢。在此，裸眼的低靈敏度主要是由于紫外線光源的位置和角度變化、水凝膠的表面光反射、環境光的干擾等導致激發光強度不一致，這也是裸眼檢測的共性問題。據報道，當傷口細菌數量達到10⁵左右時，通常可被認定為感染。因此，雖然可以通過裸眼觀察識別已感染的傷口，但為了實現感染的早期發現，還是需要借助智能手機檢測裝置。

圖2. (a) 裸眼觀察和(b) 基于智能手機的檢測設備進行大腸桿菌檢測示意圖以及記錄的熒光照片。

為了方便檢測，自主開發了Android APP命名為“Pathogenic Detection”用于快速準確地檢測和診斷傷口細菌感染情況。該APP主要用于通過測量不同濃度細菌—智能傷口敷料共孵育的熒光強度（轉換為RGB值）來分類感染水平。如前所述，10⁵ CFU/mL的細菌量被認為是傷口感染的臨界閾值。同時，為了及時發現傷口細菌，將智能傷口敷料—細菌共培養1小時后的熒光強度作為判斷傷口感染的標準。通過分析大量結果后設定：當RGB值中的B值低于124時，將感染級別定義為“Low-risk”；當B值處于124—184時，將感染級別定義為“Infected”；當B值高于184時，將感染級別定義為“Severe”。在此，不同的診斷水平可作為選擇相應抗菌治療策略的參考。例如，“Low-risk”結果表示無需進行抗菌治療，而“Infected”結果則需要立即進行PDT抗菌治療。一旦檢測到“Severe”級，有必要增加抗菌治療的頻率。此外，該APP與基于智能手機的檢測設備相結合，可以在幾秒鐘內檢測和診斷傷口感染情況。

圖3. “Pathogenic Detection”APP手機界面及檢測流程，所用智能手機為小米Redmi K30 Ultra。

將智能傷口敷料浸入大腸桿菌—金黃色葡萄球菌混合懸液中評價其體外細菌檢測和抑制能力。在細菌剛接觸敷料時，由于沒有生成4-MU，所有組的B值都處于“Low-risk”水平。此外，未添加細菌的敷料隨著時間的推移，B值始終低于100。然而，添加細菌的敷料在培養3 h后B值增加到150左右，即“Infected”。此外，實驗組在培養6 h后B值升高至170左右，仍處于“Infected”水平，而敷料+細菌組的B值約為240，處于“Severe”水平。這種差異主要是由于敷料+細菌組未經近紅外照射（無抗菌效應），因此敷料的熒光強度隨著細菌的增殖而不斷增加。相反，實驗組在NIR照射下，大部分細菌在3 h時被光敏抗菌劑產生的ROS消滅，殘留的β-GUS和細菌導致熒光信號增長緩慢。

圖4. 智能傷口敷料體外原位致病菌檢測與抑制測試。(a) 體外細菌檢測及抑制示意圖及(b)試驗結果。(c) 采用基于智能手機的檢測系統檢測實驗組的檢測診斷結果。

該研究采用全層皮膚缺損SD大鼠，評價了智能傷口敷料的體內細菌檢測及抑制作用。與正常傷口相比，在紫外線照射下，感染傷口可見藍色熒光。感染創面第0天通過智能手機檢測系統測得B值約為221，明顯高于正常組(約120)，表明創面處于“Severe”感染階段。感染創面B值隨著近紅外光處理逐漸降低，直至與正常組一致，說明創面細菌數量減少，并得到有效抑制。提取不同時間點創面滲出液進行細菌培養。近紅外光處理后的細菌數量明顯減少。第6天幾乎沒有觀察到明顯的菌落。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的存活率均降至5%以下。值得一提的是，該研究中的抗菌治療僅在敷料更換時進行。因此可以推斷，增加抗菌治療次數將加速細菌清除效果。以上結果表明，該智能傷口敷料具有良好的細菌檢測和響應性抗菌能力，可作為一種新型傷口敷料用于傷口感染的原位檢測和按需抗菌治療。

圖5. 智能傷口敷料體內原位致病菌檢測與抑制。(a) 體內細菌檢測與消滅示意圖。(b) 用裸眼觀察感染和正常SD大鼠傷口敷料的熒光。(c) 基于智能手機的檢測系統檢測結果。(d) 感染傷口菌落計數。

兼具原位檢測和清除細菌的智能傷口敷料可以準確評估創面細菌感染情況，根據需要進行精準抗菌治療，從而提高創面護理效率，促進創面個性化治療。然而，目前這類敷料報道較少。雖然可以通過在敷料中嵌入復雜的生物傳感器或電子元件來實現原位細菌檢測，但是較高的生產成本和復雜的傷口護理方式具有應用局限。同時，以往主要基于傷口溫度、pH變化判定傷口感染程度的方式，其準確性往往受環境和人體生理干擾因素較大。此外，盡管使用顏色變化作為傷口感染檢測是一種方便實用的方法，但是僅僅依靠裸眼識別和判斷的視覺檢測方法往往受到個體感官差異的影響。由于當前智能手機的廣泛使用和固有優勢，包括高效率、非侵入性、便攜性以及安裝第三方APP作為信號讀取器的能力，因此基于智能手機的POCT方法受到了較高關注。此外，傷口愈合的實時過程數據可以根據需要傳送給遠程醫療人員，從而實現遠程護理。

該研究研制了一種能同時原位檢測和清除致病菌的智能傷口敷料。其中，細菌的存在可以通過跟蹤敷料的藍色熒光直觀地檢測出來。同時，利用構建的基于智能手機的檢測系統，在達到感染極限前對病原菌進行檢測和診斷。此外，該智能敷料通過近紅外照射下的光動力抗菌效應，能夠有效地按需殺滅創面關鍵致病菌。該研究提出的智能傷口敷料能夠在早期及時發現和治療感染性病原體，有利于傷口管理。該項成果以“Intelligent Wound Dressing for Simultaneous in situ Detection and Elimination of Pathogenic Bacteria”為題發表在Acta Biomaterialia期刊上。福州大學楊建民副教授為本論文第一作者，通訊作者為石賢愛教授和日本東京都立大學的毛思鋒助理教授，其中所用的Android APP為福州大學高躍明教授團隊設計開發。該研究工作得到了福建省自然科學基金、福建省海洋經濟發展專項等項目的資助。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.11.045

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（責任編輯：xu）

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