基底模量已被廣泛認可是影響細胞行為和功能的關鍵因素之一。例如，低模量基底促進神經突延伸，而抑制神經膠質細胞遷移和增殖。人源間充質干細胞（hMSCs）可在與相應組織模量相似的基底上分別分化為神經元、成肌細胞和成骨細胞（彈性模量E為0.1-40 kPa）。多種因素尤其是模量的有效解耦對于厘清不同材料表面性質對細胞行為的影響至關重要。目前關于基底模量對于體外細胞行為影響的眾多結果尚未系統地與具有更復雜的生物力學、化學和拓撲特征的體內真實微環境相關聯。尤其是，在對于模量迥異的硬、軟兩種類型的組織進行修復，在材料的力學需求上是否具有傾向性，是組織工程和生物材料領域的重要問題。
近日，中山大學材料科學與工程學院王山峰教授團隊為全面、系統地回答這個問題，以“Opposite Mechanical Preference of Bone/Nerve Regeneration in 3D-printed Bioelastomeric Scaffolds/Conduits Consistently Correlated with YAP-Mediated Stem Cell Osteo/Neuro-genesis”為題發表在《Advanced Healthcare Materials》上（DOI：10.1002/adhm.202301158）。文章第一作者為中山大學材料科學與工程學院2019級博士畢業生成肖鵬，主通訊作者為其導師王山峰教授。相關成果該研究得到國家自然科學基金（51973242和81602205）和中山大學“百人計劃”啟動經費的支持。在這項工作中，作者首先制備了一種新型可光固化非晶型聚合物：聚三亞甲基碳酸酯富馬酸酯（PTMCF，中國發明專利申請號：202011000150.4），通過調控前驅體分子量可有效調控交聯網絡的力學性能，而不改變其表面性能包括浸潤性和蛋白吸附能力。該聚合物可通過模具法和面投影微立體光刻技術（PμSL）分別制備具有單因素變量（模量）的二維基底和三維支架，并分別用于研究模量對體外人源間充質干細胞行為以及體內軟硬組織再生的影響（圖1）。
圖1. 生物可降解彈性體調節hMSCs的命運和體內骨/神經組織再生。
通過改變前驅體分子量（500、1000和2000 g/mol：0.5k、1k和2k）可有效調控交聯網絡力學性能（圖2a,b），PTMCF0.5k、1k和2k的拉伸模量（E）分別為：990 ± 80 kPa、680 ± 130 kPa和90 ± 11 kPa。在PBS中模擬降解長達兩年后，PTMCF0.5k、1k和2k的殘余質量比分別為44 ± 9%、59 ± 7%和66 ± 13%（圖2c）。此外，PTMCF網絡具有簡易合成、透明、可打印性、可生物降解性、優異的E和斷裂伸長率（εbreak）等特點，總體上優于大多數已報道的彈性體（圖2d）。圖2e為眾多彈性體的E與εbreak的Ashby圖，以比較PTMCF彈性體與現有報道的光固化打印生物可降解彈性體和用于細胞力學信號傳導的彈性體。這里可以看到PTMCF彈性體的εbreak可以達到550%，在兩對比組中優于大多數文獻報道的彈性體，且PTMCF的E位于常用于調節干細胞命運的模量范圍內。
圖2a. PTMCF生物彈性體的力學性能：（a）應力應變曲線和（b）拉伸與剪切性能統計；（c）37 °C 下PTMCF網絡在PBS中的降解曲線。（d）PTMCFs與典型生物彈性體在簡易合成、透明度、生物降解性、拉伸模量、斷裂伸長率和歸一化可打印性的比較。（b）PTMCF、立體光刻打印生物降解彈性體和細胞力學傳導彈性體的εbreak和E的Ashby圖。
PTMCF0.5k與2k中較高密度的碳碳雙鍵可以保證打印的流暢性。此外，由于PTMCF0.5k的超低粘度，其樹脂中的聚合物成分可高達90%。優化聚合物樹脂配方以及打印參數后采用PμSL打印了高分辨率的三維gyroid骨修復支架結構、單通道神經導管和血管網絡（圖3a），而且PTMCF神經導管具有較高的柔韌性，可以抵抗彎曲、扭轉等變形而不被破壞且可回復至最初形狀（圖3b）。更重要的是，用于體內股骨和坐骨神經修復的支架和導管具有相似的三維微結構和不同的力學性能：PTMCF0.5k和2k骨支架的壓縮模量分別為580 ± 90和85 ± 13 kPa，PTMCF0.5k和2k神經導管的法向剛度分別為8.5 ± 1.4和1.6 ± 0.3 N/mm。
圖3. Gyroid支架、單通道神經導管和血管網絡支架（從左至右）模型圖以及相應的實物SEM圖。（b）PTMCF2k神經導管的柔韌性展示。（c）PTMCF0.5k和2k的gyroid支架的壓應力應變曲線，（d）神經導管徑向壓縮力-位移曲線。
當模量處于90-990 kPa范圍內，hMSCs粘附、增殖與模量（剛度）呈正相關。細胞粘著斑蛋白（FAs）是細胞感應外界機械力的中心樞紐，亦是整合素-細胞外基質連接細胞骨架的橋梁。圖4a結果表明高模量基底上的hMSCs通過募集更多的FAs從而進行細胞鋪展。整合素-FAs已被發現可介導Hippo通路并與Yes-associated protein（YAP）產生相互作用。這里作者發現YAP對于FAs的形成以及細胞鋪展至關重要（圖4a）。相較抑制YAP的轉錄活性，在無YAP抑制條件下的hMSCs表現出模量依賴性，模量介導YAP轉錄活性（圖4b,c）。通過基因和蛋白表明發現在模量位于90-990 kPa范圍內，較硬基底可顯著促進hMSCs成骨分化，較軟基底可促進hMSCs成神經分化，且YAP轉錄活性是驅動hMSCs分化的關鍵（圖4d）。
圖4. （a）使用或不使用YAP抑制劑verteporfin在PTMCF基底上培養hMSCs 一天后的三重免疫熒光染色。（b）hMSCs在PTMCF不同模量基底上培養1d的細胞響應機制。（c）定量分析不同PTMCF基底上hMSCs的YAP核質比。（d）qRT-PCR分析PTMCF基底上培養不同時間的hMSCs成骨相關基因和成神經元相關基因表達。
將3D打印支架植入SD大鼠股骨髁缺損模型，8周后進行觀察（圖5a）。植入的gyroid支架可為體內的細胞增殖、遷移和分化提供適宜的生理環境。結果表明高模量支架可顯著促進大鼠股骨修復（圖5b）。將3D打印導管植入SD大鼠坐骨神經缺損模型，在修復過程中進行電生理測試，并在12周后進行組織切片染色觀察等（圖5c），結果表明適宜的低基質模量可以加速雪旺細胞的的遷移增殖，促進賓格內氏帶（Bungner''s bands）的形成，進而促進新的神經纖維和髓鞘形成。基質模量可以影響大鼠周圍神經恢復，且適宜的低模量可以促進其恢復，顯示出與骨組織修復相反的趨勢。
圖5. （a）3D打印支架用于體內股骨修復以及（b）8周后修復樣本的計算機斷層掃描三維重構圖片。（c）3D打印導管用于體內坐骨神經修復以及（d）12周后修復樣本截面的組織切片然和和透射電鏡圖。
通過轉錄組學得到的模量介導周圍神經修復潛在機制：適宜的模量可促進細胞整合素表達，激活FAK磷酸化并進一步活化Rho家族蛋白，從而激活下游蛋白以形成Arp2/3復合物，促進肌動蛋白成核與聚合，并形成絲狀偽足、微突起和板狀偽足，促進神經元生長并進一步修復周圍神經（圖6）。上述結果揭示了在低于1 MPa基底或支架模量上體外hMSCs響應和體內骨與神經組織修復的影響趨勢。作者特別選擇了更有爭議的周圍神經作為代表使用RNA測序在轉錄組水平上探索基底模量介導周圍神經的潛在機制。對于特定的細胞和組織為什么會存在一個最佳的模量范圍，以及在組織修復過程中，最佳模量范圍的基底在體內微環境中是如何促進組織修復的，這是組織工程領域中的關鍵但目前尚未完全闡釋清楚的科學問題。未來需要完成更全面和更深入的實驗，如制備更寬范圍的模量基底與支架以及多組學數據間的關聯從而探尋上述的最佳模量范圍以及深入研究模量介導的骨和周圍神經修復的作用機制。
圖6. 模量介導周圍神經再生的潛在機制示意圖。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202301158
