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  當前全球老齡化形勢嚴峻，老年患者骨再生能力不足。一方面，衰老骨髓間充質干細胞（BMSCs）成骨分化能力顯著下降，線粒體功能障礙導致能量代謝異常。另一方面，衰老相關分泌表型（SASP）產生促炎因子和活性氧（ROS），抑制成骨和血管生成。現有療法存在局限，單純清除衰老細胞和抑制SASP未能同時解決BMSCs與微環境間的復雜交互作用。

  針對以上難題，蘇州大學附屬第一醫院朱雪松/張一健/蔣定華團隊和華東理工大學袁媛團隊聯合開發了一種過表達NAD依賴性去乙酰化酶Sirtuin 3（SIRT3）的聚癸二酸甘油-共聚乙二醇/聚丙烯酸（PEGS /PAA）水凝膠，并用于治療老年性骨缺損。此基因工程水凝膠的主要創新點在于：1. 通過緩解BMSCs的衰老損傷并清除SASPs，顯著促進成骨分化；2. 通過螯合周圍鐵離子，構建了局部促骨生成的低氧微環境；3. 通過調控巨噬細胞極化相關的免疫信號通路，加速老年骨組織修復。

  該工作以"An "inside-out"-guided genetically engineered hydrogel for augmenting aged bone regeneration" 為題發表于《Bioactive Materials》雜志。

圖1. 基于“內外兼修”理念設計基因工程水凝膠并用于治療老年性骨損傷示意圖。過表達SIRT3的PEGS /PAA@SIRT3水凝膠的制備流程。在細胞內，SIRT3過表達增強成骨能力，減輕BMSCs的衰老損傷（胞內作用）。在細胞外，PEGS /PAA中的羧基螯合鐵離子以模擬缺氧條件并促進HIF-1α表達（胞外效應）。這些聯合機制延緩細胞衰老，促進骨愈合。

  通過構建成年（6月齡）和老齡（18月齡）大鼠臨界顱骨缺損模型，評估骨缺損修復能力差異。使用單細胞數據分析衰老環境對骨組織細胞亞群的改變，并篩選出SIRT3在衰老進程中發揮重要作用。成年大鼠在骨組織損傷后的再生情況表現出良好的愈后，而隨著年齡的增加，老齡大鼠的細胞表現出衰老表型P21、P16蛋白的組織內陽性率明顯增多，嚴重影響了骨組織的整合再生能力，表現為骨缺損的不愈合。單細胞測序的結果顯示，單細胞測序顯示祖細胞及成骨細胞群體豐度減少，細胞周期G2/M期阻滯，其特征是G2M其的增多和對低氧刺激的高敏感性。此外，衰老的骨微環境損害了膠原形成和細胞外基質的合成，SIRT3高表達的成骨細胞以及BMSCs豐度顯著下降，表明SIRT3在協調骨形成中的重要調節作用（圖2）。

圖2. 通過體內熒光染色和單細胞數據分析篩選出調控衰老進程的關鍵靶點SIRT3。

  作者通過巰基-邁克爾加成反應合成PEGS/PAA互穿網絡水凝膠，并負載包裹AAV-SIRT3的介孔二氧化硅納米顆粒。FTIR、XPS、SEM、EDS等結果均證實了水凝膠的成功制備，同時具有豐富的孔隙結構，體外釋放實驗也驗證了水凝膠的封裝使得納米顆粒實現了持續28天以上的緩釋效應。相比單純PEGS水凝膠，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠更好的實現了水凝膠在體外的降解和藥物緩釋功能，較好的解決了基因修飾納米顆粒快速降解、效能不穩定的問題。這無疑模擬了更好的骨組織微環境，同時也為損傷細胞提供了基因編輯的平臺（圖3）。

圖3. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的制備與表征。

  作者后續使用體外水凝膠與衰老細胞進行共培養。細胞周期實驗、PCR、WB等實驗，共同驗證了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠能夠有效恢復正常細胞周期，減少衰老相關分泌表型，β-半乳糖苷酶染色、細胞免疫熒光染色也得到相同結論（圖4）。

圖4. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對衰老進程的延緩作用。

  此外，PCR、WB、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等實驗結果表明PEGS/PAA@SIRT3水凝膠體系在衰老細胞中能夠顯著加速成骨分化，上調成骨相關標志物，促進鈣結節沉積，有效抵御衰老導致的成骨能力下降（圖5）。

圖5. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對成骨分化的促進作用。

  RNA-seq富集分析的結果顯示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠導致多個骨免疫相關通路和因子出現差異性表達，研究者們使用流式細胞術、細胞免疫熒光等方法探究了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對巨噬細胞極化的潛在影響，結果表明，PEGS/PAA@SIRT3顯著促進巨噬細胞M2型極化，抑制M1型極化，構建了促成骨分化的免疫微環境（圖6）。

圖6. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對骨免疫的調控作用。

  作者后續構建老齡大鼠的臨界骨缺損模型，并以此驗證PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的體內療效。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進程顯著加快。術后8周，PEGS/PAA@SIRT3組標本的骨連續性成功恢復，伴隨著故體積分數、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數量的顯著上升（圖7）。

圖7. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對老齡大鼠骨缺損的治療作用。

  為了進一步證明SIRT3在骨愈合過程中的作用，研究者在SIRT3敲除小鼠體內構建顱骨臨界骨缺損模型，并以此揭示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的優越性。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進程顯著加快。免疫組化結果證明，該水凝膠在敲除SIRT3的條件下仍舊能夠補充SIRT3的含量，在骨組織中抑制衰老標志物P16的表達，并促進骨鈣素（OCN）的增加（圖8）。

圖8. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠有效促進SIRT3敲除小鼠的骨缺損修復。

  總而言之，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠通過靶向遞送SIRT3、模擬缺氧微環境及調節免疫穩態，有效逆轉老年骨缺損區的衰老微環境，為臨床治療衰老相關性骨疾病提供創新性解決方案。

  原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X25001896?via%3Dihub