當前全球老齡化形勢嚴峻，老年患者骨再生能力不足。一方面，衰老骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）成骨分化能力顯著下降，線粒體功能障礙導(dǎo)致能量代謝異常。另一方面，衰老相關(guān)分泌表型（SASP）產(chǎn)生促炎因子和活性氧（ROS），抑制成骨和血管生成，F(xiàn)有療法存在局限，單純清除衰老細胞和抑制SASP未能同時解決BMSCs與微環(huán)境間的復(fù)雜交互作用。
針對以上難題，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院朱雪松/張一健/蔣定華團隊和華東理工大學(xué)袁媛團隊聯(lián)合開發(fā)了一種過表達NAD依賴性去乙酰化酶Sirtuin 3（SIRT3）的聚癸二酸甘油-共聚乙二醇/聚丙烯酸（PEGS /PAA）水凝膠，并用于治療老年性骨缺損。此基因工程水凝膠的主要創(chuàng)新點在于：1. 通過緩解BMSCs的衰老損傷并清除SASPs，顯著促進成骨分化；2. 通過螯合周圍鐵離子，構(gòu)建了局部促骨生成的低氧微環(huán)境；3. 通過調(diào)控巨噬細胞極化相關(guān)的免疫信號通路，加速老年骨組織修復(fù)。
該工作以"An "inside-out"-guided genetically engineered hydrogel for augmenting aged bone regeneration" 為題發(fā)表于《Bioactive Materials》雜志。
圖1. 基于“內(nèi)外兼修”理念設(shè)計基因工程水凝膠并用于治療老年性骨損傷示意圖。過表達SIRT3的PEGS /PAA@SIRT3水凝膠的制備流程。在細胞內(nèi)，SIRT3過表達增強成骨能力，減輕BMSCs的衰老損傷（胞內(nèi)作用）。在細胞外，PEGS /PAA中的羧基螯合鐵離子以模擬缺氧條件并促進HIF-1α表達（胞外效應(yīng)）。這些聯(lián)合機制延緩細胞衰老，促進骨愈合。
通過構(gòu)建成年（6月齡）和老齡（18月齡）大鼠臨界顱骨缺損模型，評估骨缺損修復(fù)能力差異。使用單細胞數(shù)據(jù)分析衰老環(huán)境對骨組織細胞亞群的改變，并篩選出SIRT3在衰老進程中發(fā)揮重要作用。成年大鼠在骨組織損傷后的再生情況表現(xiàn)出良好的愈后，而隨著年齡的增加，老齡大鼠的細胞表現(xiàn)出衰老表型P21、P16蛋白的組織內(nèi)陽性率明顯增多，嚴重影響了骨組織的整合再生能力，表現(xiàn)為骨缺損的不愈合。單細胞測序的結(jié)果顯示，單細胞測序顯示祖細胞及成骨細胞群體豐度減少，細胞周期G2/M期阻滯，其特征是G2M其的增多和對低氧刺激的高敏感性。此外，衰老的骨微環(huán)境損害了膠原形成和細胞外基質(zhì)的合成，SIRT3高表達的成骨細胞以及BMSCs豐度顯著下降，表明SIRT3在協(xié)調(diào)骨形成中的重要調(diào)節(jié)作用（圖2）。
圖2. 通過體內(nèi)熒光染色和單細胞數(shù)據(jù)分析篩選出調(diào)控衰老進程的關(guān)鍵靶點SIRT3。
作者通過巰基-邁克爾加成反應(yīng)合成PEGS/PAA互穿網(wǎng)絡(luò)水凝膠，并負載包裹AAV-SIRT3的介孔二氧化硅納米顆粒。FTIR、XPS、SEM、EDS等結(jié)果均證實了水凝膠的成功制備，同時具有豐富的孔隙結(jié)構(gòu)，體外釋放實驗也驗證了水凝膠的封裝使得納米顆粒實現(xiàn)了持續(xù)28天以上的緩釋效應(yīng)。相比單純PEGS水凝膠，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠更好的實現(xiàn)了水凝膠在體外的降解和藥物緩釋功能，較好的解決了基因修飾納米顆？焖俳到、效能不穩(wěn)定的問題。這無疑模擬了更好的骨組織微環(huán)境，同時也為損傷細胞提供了基因編輯的平臺（圖3）。
圖3. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的制備與表征。
作者后續(xù)使用體外水凝膠與衰老細胞進行共培養(yǎng)。細胞周期實驗、PCR、WB等實驗，共同驗證了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠能夠有效恢復(fù)正常細胞周期，減少衰老相關(guān)分泌表型，β-半乳糖苷酶染色、細胞免疫熒光染色也得到相同結(jié)論（圖4）。
圖4. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對衰老進程的延緩作用。
此外，PCR、WB、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色等實驗結(jié)果表明PEGS/PAA@SIRT3水凝膠體系在衰老細胞中能夠顯著加速成骨分化，上調(diào)成骨相關(guān)標志物，促進鈣結(jié)節(jié)沉積，有效抵御衰老導(dǎo)致的成骨能力下降（圖5）。
圖5. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的對成骨分化的促進作用。
RNA-seq富集分析的結(jié)果顯示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠導(dǎo)致多個骨免疫相關(guān)通路和因子出現(xiàn)差異性表達，研究者們使用流式細胞術(shù)、細胞免疫熒光等方法探究了PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對巨噬細胞極化的潛在影響，結(jié)果表明，PEGS/PAA@SIRT3顯著促進巨噬細胞M2型極化，抑制M1型極化，構(gòu)建了促成骨分化的免疫微環(huán)境（圖6）。
圖6. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對骨免疫的調(diào)控作用。
作者后續(xù)構(gòu)建老齡大鼠的臨界骨缺損模型，并以此驗證PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的體內(nèi)療效。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進程顯著加快。術(shù)后8周，PEGS/PAA@SIRT3組標本的骨連續(xù)性成功恢復(fù)，伴隨著故體積分數(shù)、骨密度、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量的顯著上升（圖7）。
圖7. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠對老齡大鼠骨缺損的治療作用。
為了進一步證明SIRT3在骨愈合過程中的作用，研究者在SIRT3敲除小鼠體內(nèi)構(gòu)建顱骨臨界骨缺損模型，并以此揭示PEGS/PAA@SIRT3水凝膠的優(yōu)越性。Micro-CT重建分析顯示PEGS/PAA@SIRT3組骨再生進程顯著加快。免疫組化結(jié)果證明，該水凝膠在敲除SIRT3的條件下仍舊能夠補充SIRT3的含量，在骨組織中抑制衰老標志物P16的表達，并促進骨鈣素（OCN）的增加（圖8）。
圖8. PEGS/PAA@SIRT3水凝膠有效促進SIRT3敲除小鼠的骨缺損修復(fù)。
總而言之，PEGS/PAA@SIRT3水凝膠通過靶向遞送SIRT3、模擬缺氧微環(huán)境及調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)，有效逆轉(zhuǎn)老年骨缺損區(qū)的衰老微環(huán)境，為臨床治療衰老相關(guān)性骨疾病提供創(chuàng)新性解決方案。
原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2452199X25001896?via%3Dihub
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