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  近日，香港科技大學唐本忠院士團隊在Science伙伴期刊《Research》發表了題為“A Simple Approach to Bioconjugation at Diverse Levels: Metal-Free Click Reactions of Activated Alkynes with Native Groups of Biotargets without Prefunctionalization” 的研究論文。在該工作中，作者發展了一種簡單的無金屬參與、無預修飾生物偶聯新策略，實現多級對象的標記功能化，如天然高分子、合成高分子、多肽、蛋白質、活細胞、細菌，甚至無機材料表面修飾等。

  在生物醫學領域，探索生物分子的結構、示蹤其發揮作用的內在機制與過程非常重要，但是采用什么技術手段使這些內在過程“可視化”非常富有挑戰。目前，多數生物分子和生物材料自身沒有可以用作有效觀察的熒光，通常采用偶聯熒光分子或者其它成像單元來實現生物靶標分子的示蹤。生物偶聯反應通常要求反應效率高，不產生額外副產物或僅產生氮氣或水。傳統的生物偶聯策略往往需要重金屬催化，如銅，或需要復雜的多步前修飾處理，重金屬殘留造成的潛在毒性不利于后續生物應用；待修飾對象的結構復雜性限制了其預修飾；如蛋白質是生命體中重要的構筑單元，其結構和功能非常復雜，預修飾本身已存在顯著挑戰。另外，針對活細胞的全細胞成像，甚至生命體的熒光標記始終是個難題，傳統采用基因手段，但操作復雜，不確定性高。總之，由于被修飾生物對象的復雜性，迫切需要發展一種廣泛適用、不需要預修飾的直接偶聯策略，用于不同生物靶標分子甚至生命體的直接修飾標記，具有重要學術與轉化價值。

  在過去二十余年里，唐本忠院士團隊一直關注三鍵單體的高分子聚合方法學。近幾年，唐本忠院士團隊秦安軍教授等發展了炔類單體與胺類單體、硫醇單體、醇類單體等的高效點擊聚合反應 (J. Am. Chem. Soc. 2017, 139, 5437-5443; Macromolecules 2015, 48, 7782-7791; Macromolecules 2014, 47, 1325-1333; Adv. Fun. Mater. 2010, 20, 1319-1328; Chem.-A Eur. J. 2017, 23, 10725-10731; Polym. Chem. 2017, 8, 2713-2722)。基于此，近日唐本忠院士團隊通過活化炔與胺基、硫醇、醇的高效偶聯反應，實現多級對象的生物偶聯標記 (圖1)。并分別舉例進行概念性說明，如基于伯胺與活化炔的生物偶聯策略，可用于修飾殼聚糖或一步法簡易實現PEGylation, 偶聯產物具有發光特性，可用于細胞成像等 (圖2)。

圖1. 基于活化炔的多級生物偶聯平臺可以實現多級對象的無預修飾偶聯熒光標記

圖2. 基于伯胺與活化炔的生物偶聯策略修飾殼聚糖和簡易實現PEGylation

  其次，基于巰基與活化炔的高效偶聯可用于合成高分子端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產物)，為后續合成高分子的生物應用提供了眾多可能；基于羥基與活化炔的偶聯可用于多糖改性，此過程僅需要加入催化量的有機堿，不需要添加重金屬催化劑 (圖3)。在廣泛驗證了活化炔與胺基、硫醇和醇類反應性以后，作者利用多肽和蛋白質固有的伯胺或巰基進行無金屬催化的生物偶聯標記，并對多肽和蛋白質的性質和功能進行初步驗證 (圖4)。

圖3. 基于巰基與活化炔的偶聯用于合成高分子端基修飾 (如RAFT聚合的高分子產物), 基于羥基與活化炔的偶聯也可用于多糖改性

圖4. 基于多肽和蛋白質固有的伯胺、巰基進行無金屬催化的生物偶聯標記

  隨后，作者嘗試將活化炔用于復雜體系的偶聯標記研究。如將活化炔小分子直接用于細胞標記染色，并以不含炔的熒光小分子或炔被加成后的熒光產物進行平行試驗，驚奇地發現，活化炔熒光探針可以在短短2分鐘內完成全細胞染色，而對照分子不能在如此短的時間里完成染色 (圖5)。基于活化炔與胺基或巰基快速偶聯特征，作者推測活化炔小分子首先與細胞膜表面富含的胺基和巰基的蛋白質快速反應，這些蛋白質向細胞內快速轉運過程中同時帶入標記的熒光探針，從而實現全細胞的快速標記。

  最后，作者分別選取典型的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，進一步將上述三種熒光分子與這些細菌分別培養，發現活化炔熒光分子在2分鐘內完成陽性菌快速染色，而兩個對照熒光分子與兩種典型的陽性菌共孵育30分鐘都無法染色陽性菌；另外，包括活化炔熒光分子在內的三種熒光分子均無法在短時間內染色標記革蘭氏陰性菌；綜合分析，陽性菌膜表面富含大量突起的磷壁酸組分，其含有大量伯胺基元，可以快速與活化炔熒光分子反應，從而快速染色陽性菌，而陰性菌膜表面沒有磷壁酸組分，且其復雜的膜結構本身就不利于小分子物理滲入 (圖6)，預期基于活化炔的熒光探針將為細菌快速識別篩選提供重要幫助。

圖5. 基于活化炔的熒光探針可以快速全細胞染色，兩分鐘可以完成染色

圖6. 基于活化炔的熒光探針快速識別染色革蘭氏陽性菌并染色，兩分鐘可完成

  基于活化炔的高效偶聯，作者還驗證了該偶聯策略在無機材料表面修飾上的應用，如微米級二氧化硅球的熒光標記。總之，本文基于活化炔廣泛的基團反應性，針對生物醫學應用中的不同靶標分子和需求，如PEGylation、合成高分子、天然多糖、多肽、蛋白質，活細胞快速染色、活細菌識別標記等，進行了概念性驗證，證明活化炔在無金屬生物偶聯、生物醫學中具有重要應用前景。

  該工作近期發表在Science合作期刊Research, 2018, 3152870，通訊作者為唐本忠院士 (香港科技大學課題組主頁：http://tangbz.ust.hk/tbz.html)，第一作者為胡祥龍博士和博士生趙學千，其中，胡祥龍博士受到“香江學者計劃”資助，在香港科技大學唐本忠院士課題組開展研究工作，現任職于華南師范大學，其個人簡介如下：http://biop.scnu.edu.cn/a/20150812/33.html。

  論文鏈接：https://spj.sciencemag.org/research/2018/3152870/