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川大華西口腔醫學院彭強研究員團隊 AHM：多功能再生硅-殼聚糖水凝膠促進MRSA感染的糖尿病創面愈合
2023-11-21  來源：高分子科技

  慢性創面是糖尿病的常見并發癥，可導致感染、截肢甚至死亡，為患者、家庭及社會帶來了沉重的醫療負擔。慢性創面局部長期反復的細菌感染、持續的炎癥狀態、過度的氧化應激反應、組織細胞功能失調及血管再生障礙等是導致其遷延不愈的主要原因。創面敷料是覆蓋在創口表面，用以保護創口免受感染及進一步損傷并促進創面愈合的材料，在創面護理中發揮著不可或缺的作用。傳統的創面敷料，如紗布、醫用脫脂棉、繃帶等，雖可為創面愈合提供一定的保護作用，但缺少主動的生物活性，治療效果不甚理想。因此，開發一種能夠適應并調節復雜創面微環境的多功能生物活性敷料對于促進慢性創面修復愈合、恢復機體屏障功能具有非常重要的意義。



  近日，四川大學華西口腔醫學院彭強研究員團隊制備了一種負載再生硅（Regeneration silicon, Regesi）的殼聚糖（Chitosan, CS）水凝膠，其在保留CS水凝膠良好生物相容性的基礎上，具有顯著增強的抗菌、抗氧化和促進成纖維細胞增殖遷移的能力，可有效控制糖尿病小鼠創面感染，促進損傷局部肉芽組織再生、膠原沉積、血管再生和再上皮化，顯著加快軟組織創面愈合，展現出安全高效的治療效果（圖1）。 


圖1. Regesi-CS水凝膠的制備及其對糖尿病感染創面的治療作用示意圖


Regesi-CS水凝膠的制備及其性能表征


  首先，作者將不同濃度的Regesi懸液與CS溶液直接混合，通過冷凍干燥及水化處理得到不同比例的Regesi-CS水凝膠：Regesi-CS（0.5%-1%）、Regesi-CS（1%-1%）及Regesi-CS（2%-1%）。SEM下觀察各組水凝膠凍干支架均呈相互連通的三維多孔結構，隨Regesi含量的增多，材料的表面粗糙度逐漸增加，孔徑及孔隙率逐漸減小，最大溶脹率和降解率逐漸下降（圖2）。其中，Regesi-CS水凝膠適宜的孔徑及孔隙率有利于氧氣、營養物質和代謝廢物的轉運，適于組織細胞的粘附和生長；較強的親水和溶脹性能有利于更好地吸收創面滲出物并維持局部濕潤環境；較好的降解性能有利于為慢性創面提供穩定的屏障保護作用，增加了其作為軟組織修復材料的應用潛力。 


圖2. Regesi-CS水凝膠的制備及其性能表征


Regesi-CS水凝膠的抗菌性能


  長期反復的細菌感染是導致慢性創面遷延不愈的重要因素之一。其中，金黃色葡萄球菌（S. aureus）和大腸桿菌（E.coli）是創面感染細菌的典型代表，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）等多重耐藥菌的出現則進一步加劇了慢性創面感染控制的挑戰。因此，在該項研究中，作者通過平板菌落計數法和細菌活/死染色實驗探究了Regesi-CS水凝膠對S. aureus、E.coli和MRSA的抗菌活性（圖3）。結果顯示，無論細菌種類或培養時間如何變化，Regesi-CS水凝膠均呈現Regesi濃度依賴的抗菌效應，其中Regesi-CS（1%-1%）具有最強的抗菌活性，Regesi-CS（0.5%-1%）的抗菌活性與CS相當，而Regesi-CS（2%-1%）的抗菌活性最弱。SEM觀察結果亦證實，Regesi-CS水凝膠具有破壞細菌細胞壁并抑制細菌分裂增殖的潛在作用，其中以Regesi-CS（1%-1%）的作用最為突出。 


圖3. Regesi-CS水凝膠對S. aureus、E.coli和MRSA的抗菌活性


Regesi-CS水凝膠對L929細胞粘附、增殖及遷移的影響


  良好的生物相容性是創面敷料的基本要求之一，也是醫用材料實現臨床轉化應用的重要前提。因此，作者分別通過CCK-8實驗、細胞活/死染色實驗和細胞粘附實驗對Regesi-CS水凝膠的體外細胞相容性進行了探究（圖4）。結果表明，單純Regesi懸液具有Regesi濃度依賴的細胞毒性，將其負載于CS水凝膠中可顯著改善這一不足，使得Regesi-CS水凝膠，尤其是Regesi-CS（1%-1%），顯示出良好的生物相容性，并可顯著促進成纖維細胞的粘附和鋪展。因此，結合生物相容性及抗菌實驗結果，Regesi-CS（1%-1%）被選定為唯一比例用于后續細胞及動物實驗的研究。進一步CCK-8和細胞劃痕實驗結果表明，1% Regesi可顯著抑制L929細胞的增殖和遷移活性，而CS及Regesi-CS（1%-1%）均可顯著促進細胞增殖和遷移，其中以Regesi-CS（1%-1%）的促進作用更為顯著。 


圖4. Regesi-CS水凝膠的體外生物相容性及其對L929細胞增殖及遷移的影響


Regesi-CS（1%-1%）水凝膠的抗氧化性能


  研究表明，慢性創面局部過量的ROS不僅可誘導和加劇炎癥反應，還可介導細胞凋亡，破壞組織細胞的正常代謝和功能，導致創面愈合延遲甚至不愈。因此，清除過量的ROS對促進慢性創面愈合具有重要意義。在本研究中，作者發現，Regesi-CS（1%-1%）水凝膠可顯著降低氧化應激條件下細胞內的ROS水平，并保護成纖維細胞免受氧化損傷（圖5）。 


圖5. Regesi-CS水凝膠的抗氧化作用


Regesi-CS（1%-1%）水凝膠對糖尿病感染創面的體內治療效果


  為進一步明確Regesi-CS（1%-1%）水凝膠對慢性創面的體內治療效果，作者建立了MRSA感染的糖尿病小鼠全層皮膚缺損模型，并分別給予生理鹽水、1% Regesi懸液、CS或Regesi-CS（1%-1%）水凝膠治療（圖6-8）。較其他組而言，Regesi-CS（1%-1%）水凝膠可顯著抑制耐藥菌MRSA在創面的定植和存活，有效控制創面感染，并顯著加速糖尿病小鼠感染創面的愈合。組織學染色結果表明，Regesi-CS（1%-1%）水凝膠可促進創面肉芽組織生成和再上皮化，增強膠原組織沉積和成熟，并促進創面血管再生，同時未造成主要臟器的病理學改變，顯示出較強的組織再生修復能力和良好的體內安全性。綜上，Regesi-CS（1%-1%）水凝膠在體內慢性創面的治療中展現出了良好的抗感染和促修復效果，具有較大的臨床應用潛力。 


圖6. Regesi-CS水凝膠對MRSA感染的糖尿病小鼠創面愈合的影響 


圖7. 創面組織的H&E及Masson染色

圖8. 創面組織的CD31和α-SMA免疫組化染色


  2023年11月13日，該工作以“Multifunctional Regeneration Silicon-Loaded Chitosan Hydrogels for MRSA-Infected Diabetic Wound Healing”為題發表在《Advanced Healthcare Materials》上。文章第一作者是四川大學華西口腔醫學院畢業，現工作于中日友好醫院口腔醫學中心的徐靜晨博士和南方醫科大學口腔醫院的林瑤博士，通訊作者為四川大學華西口腔醫學院彭強研究員和陳嵩教授。該研究得到國家自然科學基金(No. 81973261）和中央高水平醫院臨床科研業務費（2023-NHLHCRF-BQ-36）的資助。


  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adhm.202303501

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（責任編輯：xu）
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