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  癌癥的特征是多種遺傳改變或突變所引起的異常代謝和增殖。腫瘤細(xì)胞在藥物代謝過(guò)程的基因突變或藥物靶點(diǎn)的修復(fù)可引起細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)療法的耐受。最近，一種新型的簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）/CRISPR相關(guān)酶（Cas）， Cas13a（以前稱為C2c2）被鑒定為RNA導(dǎo)向的靶向RNA的CRISPR效應(yīng)子。Cas13a / CRISPR RNA（crRNA）復(fù)合物在靶標(biāo)目的RNA后同樣會(huì)激活一般的RNase活性，導(dǎo)致細(xì)胞RNA的非特異性裂解，并最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡或休眠（即“附帶效應(yīng)”）。這種獨(dú)特的“附帶效應(yīng)”自動(dòng)繞過(guò)了實(shí)體瘤對(duì)傳統(tǒng)療法的復(fù)雜耐藥性和逃逸機(jī)制，從而使CRISPR / Cas13a系統(tǒng)成為癌癥治療的理想治療劑，具有降低有效劑量和最小化的耐藥性的潛能。

  但是，這種“附帶效應(yīng)”并不是專門針對(duì)腫瘤細(xì)胞的，因?yàn)橐坏┤魏渭?xì)胞的RNA達(dá)到與Cas13a/crRNA復(fù)合物的互補(bǔ)結(jié)合，它就可以被激活。當(dāng)全身施用基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的藥物時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致與腫瘤以外的組織中不希望的細(xì)胞死亡有關(guān)的安全性問(wèn)題。因此，僅在腫瘤細(xì)胞中限制CRISPR / Cas13a系統(tǒng)激活的可行策略對(duì)于基于CRISPR/ Cas13a的藥物在癌癥治療中的安全應(yīng)用至關(guān)重要。

圖1. DLNP用于有效癌癥免疫治療的示意圖。類似于僅在兩個(gè)鎖都解鎖時(shí)才能打開的雙鎖保險(xiǎn)箱，DLNP只能在低pHe和高H₂O₂濃度同時(shí)存在的微環(huán)境中釋放CRISPR /Cas13a系統(tǒng)。

  近來(lái)，南開大學(xué)劉陽(yáng)研究員和史林啟教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合天津醫(yī)科大學(xué)康春生教授團(tuán)隊(duì)合作在Advanced materials上發(fā)表文章，提出了一種可以限制CRISPR/Cas13a激活至腫瘤組織的雙鎖納米顆粒（DLNP）。DLNP具有核-殼結(jié)構(gòu)。在血液循環(huán)或正常組織中，聚合物層賦予DLNP帶負(fù)電荷的聚乙二醇化表面，可有效維持其循環(huán)穩(wěn)定性。到達(dá)腫瘤微環(huán)境后，聚合物層降解為陽(yáng)離子聚合物，從而促進(jìn)CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)在化和基因編輯的激活。類似于雙鎖保險(xiǎn)箱，只有在低pHe和高H₂O₂濃度的微環(huán)境中，DLNP才能釋放CRISPR/Cas13a系統(tǒng)。

  在這項(xiàng)研究中，選擇靶向PD-L1基因的crRNA作為模型crRNA。通過(guò)精準(zhǔn)控制CRISPR/Cas13a激活，DLNP成功地在腫瘤中富集并誘導(dǎo)PD-L1陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞死亡和免疫系統(tǒng)的活化。南開大學(xué)博士研究生張展展為本論文的第一作者，論文通訊作者為劉陽(yáng)研究員、史林啟教授和康春生教授。

圖2. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP的結(jié)構(gòu)表征

  如圖2a所示，雙鎖納米粒子DLNP通過(guò)兩步法制備完成，其中編碼CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的pDNA被負(fù)載在納米粒子的核內(nèi)，并由pH和H₂O₂雙響應(yīng)的聚合物殼層所包裹。研究人員通過(guò)zeta電位，表面非特意性蛋白吸附，熒光能量共振轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞攝取等實(shí)驗(yàn)，證明了雙鎖納米粒子的pH和H₂O₂雙特異性。

圖3. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP的生物功能表征

  研究人員隨后選擇針對(duì)PD-L1的crRNA作為模型RNA對(duì)DLNP， H₂O₂-NP和pH-NP的生物功能進(jìn)行研究，如果3所示，經(jīng)DLNP處理的B16F10（a）和GL261（b）細(xì)胞的核糖體RNA在pH 6.8/H₂O₂下顯示出類似的裂解趨勢(shì)，而在DLNP處理的4T1細(xì)胞（c）中未觀察到RNA裂解。表明誘導(dǎo)RNA切割時(shí)DLNP的TME和PD-L1雙重特異性。進(jìn)一步的細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這些結(jié)果。

圖4. DLNP, H₂O₂-NP和pH-NP體內(nèi)抑瘤效果

  隨后，研究人員對(duì)三種納米粒子的體內(nèi)抑瘤效果進(jìn)行了研究，如圖4所示，相較于H₂O₂-NP和pH-NP，DLNP可以有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存周期，提高TNF-α, IFN-γ和IL-2的表達(dá)量并可有效提高腫瘤內(nèi)CD8+ T細(xì)胞的浸潤(rùn)。表明DLNP可以有效擾亂PD-1/PD-L1通路，并實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞介導(dǎo)的抑瘤活性的恢復(fù)。

圖5. DLNP在CD8⁺T細(xì)胞阻斷模型和4T1 / B16F10共存模型中的體內(nèi)抑瘤效果。

  最后，研究人員利用aCD8a對(duì)小鼠體內(nèi)的效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行阻斷來(lái)研究DLNP的體內(nèi)作用機(jī)制，如圖5a所示，在T細(xì)胞阻斷的小鼠中，DLNP的抑瘤效果和對(duì)小鼠的生存周期影響大幅度下降，表明DLNP是通過(guò)對(duì)T細(xì)胞的激活來(lái)完成對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制。隨后，研究人員在4T1 / B16F10共存的小鼠中對(duì)DLNP的抑瘤效果進(jìn)行分析，結(jié)果表明DLNP可以選擇性殺傷高表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞而對(duì)低表達(dá)的4T1則無(wú)明顯效果。對(duì)CD8的分析數(shù)據(jù)同樣表明該結(jié)果。

  考慮到免疫效應(yīng)細(xì)胞抑制途徑的多樣性，可以通過(guò)替換特異性crRNA的靶向基因而進(jìn)行的進(jìn)一步開發(fā)可能使DLNP成為快速開發(fā)安全有效的癌癥免疫療法的通用平臺(tái)。

  論文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.201905751