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  在國家自然科學基金重點項目(51833008)和浙江省重點研發計劃(2020C01123)的資助下，浙江大學申有青教授團隊在核酸和蛋白等生物大分子遞送方面近期取得了三項重要進展, 研究成果分別發表在著名學術期刊Advanced Materials（1項）和NanoToday（2項）上。主要研究成果為：1）轉染能力不依賴于劑量的聚合物/DNA復合物(Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes, Advanced Materials 2021)；2）能夠模擬病毒轉染過程、像病毒一樣附著在細胞膜上、以膜融合途徑將自由的DNA直接注入細胞內的聚合物/DNA復合物(Virus-mimetic DNA-ejecting polyplexes for efficient intracellular cancer gene delivery, NanoToday 2021)；以及3）能夠輸送蛋白、siRNA等生物大分子的平臺技術(Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules, NanoToday 2021)。

1、轉染效率不依賴于核酸劑量的聚合物/DNA復合物

  基因療法在腫瘤治療、遺傳疾病等方面具有良好的應用潛力，其應用瓶頸是高效的核酸遞送系統。陽離子聚合物能夠中和DNA的負電荷，將其壓縮成陽離子聚合物/DNA復合物納米顆粒，長期以來被廣泛應用于核酸藥物（如治療型DNA和mRNA）的體內外基因輸送研究，是常用的非病毒基因載體，但由于其在體內的基因轉染效率相對病毒載體較低，極大阻礙了其臨床應用。 

  新冠等病毒能夠在人群中傳染，是因為其單個病毒就能完成進入人體并高效感染人體細胞的過程。但是，研究發現陽離子聚合物/DNA納米復合物的轉染能力具有很強的濃度依賴性，其轉染能力隨稀釋而降低并在低濃度時完全失去轉染能力。因而當應用于體內系統基因遞送時，能夠到達靶組織的復合物納米顆粒很少、濃度低，導致失去轉染能力。因此這種濃度依賴性轉染限制了陽離子聚合物/DNA非病毒納米復合物的體內應用。

  針對限制陽離子聚合物轉染效率的這一瓶頸問題，浙江大學申有青教授團隊的張震博士和邱娜莎博士合成了具有一系列結構類似但疏水性可調的聚甲基丙烯酸酯類聚合物（圖1a），詳細研究了其DNA轉染效率的規律，發現復合物的穩定性和內吞途徑決定了其轉染是否有劑量依賴性（圖1b）：親水性的陽離子聚合物與DNA形成的復合物是動態的，在低濃度時，該復合物顆粒會解離，剩余的小部分被內吞入溶酶體；溶酶體內過低濃度的陽離子聚合物無法引起“質子海綿效應”而無法釋放出DNA，導致失去轉染能力。通過系統研究陽離子聚合物疏水性與DNA轉染能力之間的關系發現，具有適當疏水性的陽離子聚合物與DNA形成的復合物，即使在低濃度下仍然保持了完整性，且能夠通過巨胞飲的方式進入高通透性的巨胞飲體，并直接進入胞漿，從而避開了溶酶體陷阱。因此，即使在低濃度下每個復合物仍然能夠獨立完成其感染細胞的過程，實現類似于病毒載體的非劑量依賴型DNA轉染。

  更進一步，該疏水性聚合物形成的復合物與陰離子聚谷氨酸(γ-PGA)可通過靜電相互作用產生的吸引力與其疏水性/γ-PGA親水性產生的斥力相平衡，使γ-PGA既可以在復合物表面形成一個遮蔽層，又可以在接觸細胞膜時高效剝離下來，釋放出聚合物/DNA復合物納米顆粒進行非劑量依賴型轉染。這些發現可以為設計模擬病毒載體的高效體內基因遞送系統提供指導意義。該工作近期以Dose-independent transfection of hydrophobized polyplexes發表在于 Advanced Materials .

圖1.結構類似但疏水化程度不同的陽離子單體結構及其聚合物（a），及不同疏水性復合物的基因轉染行為和基因轉染途徑（b）。b）：i) 高親水性的A100/DNA復合物通過網格蛋白介導的內吞途徑進入溶酶體；在高復合物濃度下，內涵體/溶酶體含有大量復合物以裂解內涵體，釋放DNA進入胞漿實現基因轉染；但在低濃度下大部分復合物溶脹解離，剩下的部分復合物進入內涵體/溶酶體，這些復合物濃度不足以誘導內涵體/溶酶體裂解，從而喪失轉染能力。ii) 較疏水性的B75D25可以與DNA復合形成穩定的納米顆粒，即使在非常低的濃度下仍然能夠保持完整性，且可以通過巨胞飲的方式進入滲漏型的巨胞飲體，很容易逃逸至胞漿，實現劑量非依賴性轉染。iii) B75D25/DNA復合物與γ-PGA通過平衡的親和力，形成具有核殼結構的γ-PGA/B75D25/DNA 納米復合物用于體內抑瘤。與細胞膜接觸后，γ-PGA的外殼脫落下來，釋放B75D25/DNA 復合物實現有效轉染。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1002/adma.202102219

2、仿病毒膜融合基因“注入”型納米復合物

  現有的陽離子聚合物/DNA復合物納米顆粒需要通過細胞內吞途徑進入細胞后，再在胞質釋放攜載的DNA進行轉錄表達，導致進入細胞的陽離子基因載體及其降解產物與胞質組分（如參與轉錄和翻譯的酶、轉錄因子和tRNA等生物活性物質）產生非特異性地黏附，不僅會擾亂DNA的轉錄過程，降低轉染效率，還會導致細胞毒性。此外，陽離子聚合物和DNA分子量都很大，大量的正/負靜電相互作用使得復合物納米顆粒在熱力學上非常穩定，使其難以與DNA快速解離，進一步降低了陽離子聚合物的轉染效率。與之相比，病毒載體（例如噬菌體、腺病毒等）能夠附著在細胞膜上并對其打孔，從而將攜載的基因組直接通過孔洞“注入”宿主細胞的胞質溶液中（圖 2a），既有效地避開了溶酶體陷阱造成的DNA降解，又能夠防止載體本身進入細胞對基因轉錄造成干擾，因此具有極高的轉染效率。但是，病毒載體的生物安全性較差，容易導致機體產生嚴重的免疫反應和系統毒性，顯著限制了它的臨床應用。 

  針對上述問題，團隊王國偉博士和陳思親博士綜合融匯了病毒載體和非病毒載體的優點，設計了一種腫瘤特異性酯酶觸發電荷反轉型陽離子聚合物（L4），成功構建了一種仿病毒膜融合、基因注入型基因輸送體系（L4/DNA納米復合物）。通過合成一系列具有不同烷基側鏈和不同親疏水性的酯酶觸發電荷反轉型陽離子聚合物（圖 2b），篩選出了具有仿病毒膜融合特性的高效基因輸送載體——L4。L4與帶負電的DNA能夠自組裝形成結構穩定的L4/DNA復合物納米顆粒（圖 2c, i），表面修飾γPGA能夠顯著提升其血漿穩定性和體內應用（圖 2c, ii）。該體系具有仿病毒膜融合型高效基因轉染特性的設計關鍵點之一，在于L4具備適宜長度的辛酰基側鏈，使其能夠穩固地錨定細胞膜并插入磷脂雙分子層中，將復合物納米顆粒固定在細胞膜上并使其部分暴露于細胞漿（圖 2c, iii）。該載體設計的關鍵點之二，是利用了細胞漿內含有大量的酯酶能夠快速水解L4中的酚基酯，并進一步觸發自催化酯鍵水解反應產生帶負電的聚丙烯酸，從而解離釋放DNA（圖 2c, iv）；與此同時，聚丙烯酸與DNA自身的強靜電互斥作用，能夠將DNA直接“注入”細胞質中實現高效的基因轉染（圖 2c, iv）。

  因此，通過載體的電荷反轉和膜融合的設計，γPGA/L4/DNA基因輸送體系成功融合了病毒載體和非病毒載體的優點，使其與腫瘤細胞接觸后能夠以仿病毒膜融合的基因遞送形式，將攜載的DNA直接“注入”細胞質中進行轉錄，不但規避了細胞內吞的陽離子載體造成的細胞毒性和對基因轉染的干擾，而且防止了溶酶體陷阱導致的DNA降解。該基因輸送系統為進一步開發模擬病毒載體的高效體內基因遞送系統提供了指導基礎。相關研究成果以“Virus-mimetic DNA-ejecting Polyplexes for Efficient Intracellular Cancer Gene Delivery”為題，于2021年6月11日發表于Nano Today上。

圖 2. 膜融合基因“注入”型納米復合物示意圖。(a) 許多病毒通過膜融合途徑將基因組“注入”宿主細胞中。（b）具有不同烷基側鏈的酯酶觸發電荷反轉型陽離子聚合物的化學結構及其電荷反轉機理。（c）γPGA/L4/DNA的制備方法及基因輸送途徑：DNA被L4壓縮成結構穩定的復合物納米顆粒后i)，用γPGA包被 ii)；一旦接觸細胞，γPGA可以剝離并暴露 L4/DNA，然后 L4 的長酰基鏈插入脂質雙層并將 L4/DNA 錨定在細胞膜上 iii)；部分朝向細胞質的 L4 被胞質酯酶觸發電荷反轉而產生負電荷iv)，從而通過強靜電互斥作用將 DNA擠壓“注入” 細胞內實現高效的基因轉染。 

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101215

3、基于單鏈寡聚核苷酸的聚合物納米囊泡用于生物大分子輸送

  向細胞內高效遞送具有治療功能的基因或蛋白質等生物大分子是當今生物醫學領域研究的熱點，而安全高效的生物大分子遞送系統是其應用的瓶頸。陽離子聚合物是廣泛研究的非病毒載體，但普通的陽離子聚合物（如PEG-PLL）等難以與短鏈、剛性的siRNA和電荷密度低且分布不均的蛋白形成穩定、輸送效率高的納米顆粒。雖然提高陽離子電荷密度可解決這一問題上，但高電荷密度顯著提高載體的細胞毒性。浙大申有青教授團隊周泉博士（現為浙大基礎醫學院研究員）和相佳佳博士發現鏈結構柔順、分子量相對較小的單鏈寡聚核苷酸，與PEG-PLL可形成復合物納米囊泡，能夠高效負載多種蛋白和siRNA，并將其高效地輸送到細胞內（圖3a）。用含20個氟尿嘧啶單元的功能性寡聚核苷酸單鏈F20，與PEG-PLL構建囊泡F20some，并對其蛋白和siRNA體內外輸送特性進行了系統研究，同時輸送F20和具有協同作用的siRNA或者功能蛋白，獲得了高抗腫瘤活性的納米制劑（圖3b）。

  該方法中單鏈核苷酸可為如適配子（Aptamers）、CpG甚至microRNA等各種核苷酸序列，因而是一個普適、高效、低毒的基因和蛋白等大分子輸送平臺。但如何進一步提高該囊泡在生理環境中的穩定性依然是未來研究的重點。該工作以Polyplex nanovesicles of single strand oligonucleotides for efficient cytosolic delivery of biomacromolecules 發表在近期 Nano Today上。

圖3. （a）基于單鏈寡聚核苷酸的聚合物納米囊泡的構建；（b）以F20作為功能型寡聚核苷酸單鏈構建納米囊泡F20some，并選取siBCL-2和RNase A作為模型siRNA和蛋白，研究了F20some對siBCL-2和RNase A的胞內遞送效果和細胞內的協同凋亡作用。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2021.101221