由于椎間盤退變（IVDD）引起的下腰背疼痛已成為發病率最高的疼痛性疾病之一，給社會經濟造成沉重的負擔。作為椎間盤（IVD）的重要結構，髓核組織（NP）與纖維環（AF）和軟骨終板（CEP）一起維持著脊柱的穩定性和生理功能。髓核細胞密度降低、基質金屬蛋白酶等相關降解因子的過度表達是IVDD的主要表現，也是細胞外基質中II型膠原（COL II）和糖胺聚糖（ACAN）的密度下降進而無法維持椎間盤正常生理功能的原因。當前臨床治療所使用的物理治療、脊柱融合術或椎間盤切除術雖然取得一定的效果，但是并不能實現髓核組織再生，從根本上逆轉IVDD。通過合適的組織工程材料向退變髓核組織遞送髓核細胞或干細胞是提高髓核組織細胞密度，恢復細胞外基質合成的直接手段，近年來也被廣泛研究。然而，遞送過程中細胞泄露導致的異位成骨、體外擴增培養髓核細胞存在去分化的風險、干細胞的活性和分化能力會在遞送后受到損害等問題在一定程度上限制了該方法的應用。研究表明存在于健康和退行性 IVD 中的干/祖細胞具有分化成髓核組織的潛能，是替代外源性細胞的理想細胞源。募集和促進這些細胞向髓核分化需要多種生物活性因子時序性參與，但目前仍缺乏既滿足合適的活性因子釋放動力學，又滿足有效募集細胞、促進細胞生長浸潤和向髓核分化的支架材料。
針對以上問題，華南理工大學國家人體組織功能重建工程技術研究中心曹曉東教授團隊報道了一種順序釋放生物活性因子的可注射微孔性微凝膠組裝體支架MA-TNS（圖1），它能夠促進細胞的浸潤和長入，并通過快速釋放基質細胞衍生因子-1a（SDF-1α）募集內源性干細胞，隨后持續釋放轉化生長因子-β1（TGF-b1）促進干細胞向髓核分化，最終實現大鼠退變髓核再生和抑制食蟹猴腰椎間盤的進一步退變。該工作以“Injectable and Microporous Microgel Assembly with Sequential Bioactive Factor Release for the Endogenous Repair of Nucleus Pulposus”為題發表在國際權威期刊Advanced Functional Materials上（Adv. Funct. Mater. 2024, 2315592）上，曹曉東教授和博士后馮琦為該文的通訊作者，華南理工大學博士研究生羅惠彤為文章第一作者。
圖1 順序釋放生物活性因子的可注射微凝膠組裝體的制備及髓核修復示意圖
為了實現SDF-1α和TGF-b1的順序釋放，研究團隊首先制備硫酸軟骨素/明膠復合納米顆粒（CGNPs）負載生長因子TGF-β1，獲得納米粒子TGF@CGNPs（圖1A）。隨后，TGF@CGNPs和趨化因子SDF-1α共同封裝到微凝膠中。該雙活性因子負載的微凝膠（MG-TNS）以雙鍵修飾的明膠（GelMA）以及雙鍵和苯硼酸雙修飾的透明質酸（HAMA-PBA）為基體材料，通過乳液法和光交聯的方式獲得（圖1B）。微凝膠通過表面上的苯硼酸基團和作為組裝劑的多巴胺修飾的透明質酸（HADA）發生苯硼酸酯鍵，形成具有連通微孔的微凝膠組裝體支架（MA-TNS）。
納米顆粒通過去溶劑化法獲得，并以靜電相互作用將TGF-b1負載于納米顆粒上。TGF@CGNPs平均粒徑為193.7 nm（圖2）。
圖2 負載TGF-β1的納米顆粒的制備和表征
乳液法制備獲得的雙活性因子負載微凝膠平均粒徑為132.6±20.9 μm，SDF-1α和TGF@CGNPs可均勻分散在微凝膠中（圖3）。經苯硼酸酯反應獲得的微凝膠組裝體MA-TNS具有連通的微孔結構。在椎間盤自然載荷頻率范圍內（25-35 rad s-1）保持穩定的凝膠狀特性。MA-TNS還具有良好的可注射、自愈合特性，能滿足髓核修復的基本需求。此外，在活性因子釋放方面，該組裝體可實現SDF-1α在前期快速釋放（7天后累積釋放量為62.4%），TGF-β1隨后持續性釋放（28天累積釋放量為46.5%），這有利于快速募集細胞和長期誘導細胞分化和促進細胞外基質沉積。
圖3 順序釋放生物活性因子的微凝膠組裝體MA-TNS的制備及理化性能表征
MA-TNS通過釋放趨化因子具有良好的募集干細胞的能力。微凝膠組裝體具有良好的細胞相容性，能夠支持干細胞增殖。隨著培養時間的延長，細胞生長進入微凝膠組裝體內部，5天長入深度約為300 μm，且封裝在微凝膠組裝體中的生物活性因子對浸潤深度沒有顯著影響。相比之下，相同組分制備的塊狀水凝膠會明顯阻礙細胞浸潤行為，細胞長入深度不隨培養時間變化。這些發現表明具有連通微孔結構的微凝膠組裝體有利于細胞浸潤（圖4）。
圖4 微凝膠組裝體募集干細胞以及促進細胞浸潤長入的能力表征
在體外分化實驗中（圖5），培養7天和21天后，與其余組相比，含有TGF-β1的組中軟骨標志性基SOX9、ACAN和COL II的表達水平明顯上調，且這種上調效果隨時間推移而增強。免疫熒光染色進一步表明，微凝膠組裝體釋放的TGF-β1顯著促進了ACAN和COL II的表達。與TGF-β1和SDF-1α同時從組裝體中快速釋放的組別（MA-TS）相比，在納米顆粒的幫助下，TGF-β1從微凝膠組裝體（MATNS）中持續釋放，能夠在細胞培養過程中保持生物活性和有效濃度，使軟骨標志性基因和蛋白高表達。因此，微凝膠組裝體MA-TNS能夠確保內源干細胞長期有效分化。
圖5 順序釋放生物活性因子的微凝膠組裝體體外誘導干細胞分化能力表征
為了評價 MA-TNS 在體內的治療效果，研究團隊采用針刺法在大鼠尾椎建立IVDD模型，并注射材料，并于術后5周和10周進行影像學和組織學分析（圖6）。與其他實驗組相比，髓核組織能維持較高的水合狀態，結構較完整，組織界限清晰。免疫組化表明MA-TNS組髓核組織中COL II和ACAN含量明顯較多（圖7），說明雙活性因子順序釋放微凝膠組裝體能夠顯著改善髓核細胞外基質代謝平衡，實現髓核再生。
圖6 微凝膠組裝體修復大鼠尾椎效果表征
圖7 微凝膠組裝體修復大鼠尾椎免疫組化表征
與大鼠等小型嚙齒類動物相比，食蟹猴的椎間盤在生物學和生物力學方面與人類椎間盤更為相近。研究團隊進一步評估了材料體系對食蟹猴腰椎間盤退變的療效（圖7）。術后6周和25周結果表明MA-TNS這一雙活性因子順序釋放微凝膠組裝體能夠抑制食蟹猴椎間盤進一步退變。本研究為組織工程退變椎間盤的功能再生提供了新思路，有望進一步應用于椎間盤退變的臨床治療中。
圖8 微凝膠組裝體治療食蟹猴腰椎間盤退變
該研究工作得到國家自然科學基金委面上項目（52073103、 52272276、51873069和52203164）以及聯合基金項目（U22A20162）等經費資助。
原文鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202315592
