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東華大學史向陽教授團隊 Nano Today：基于含磷樹狀大分子的藥物遞送系統協同增強自噬、抗炎和抗氧化治療阿爾茨海默癥
2025-02-11  來源：高分子科技

  阿爾茨海默。ˋD）是最常見的神經退行性疾病之一，其特點是神經元逐漸退化，導致認知能力逐漸下降。隨著病情的發展，患者可能完全喪失生活自理能力，難以適應周圍環境。AD的發病機制錯綜復雜，包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）的異常聚集、激活的小膠質細胞引發氧化應激和神經炎癥、神經元功能障礙等，加上血腦屏障（BBB）帶來的巨大挑戰，極大地阻礙了治療藥物向病灶區域的有效輸送。目前的單藥療法只能針對AD發展過程中的特定方面，而在解決整個病理途徑的療效有限。尋求全面調節腦部炎癥微環境以有效改善AD病理的治療策略至關重要。


  自噬被廣泛認為是一種自我保護機制，它能使細胞承受各種環境壓力，如營養或生長因子匱乏、缺氧、活性氧（ROS）或DNA損傷。加強細胞自噬以加速Aβ聚集體的分解和代謝被認為是一種很有前景的治療策略，尤其是在神經退行性疾病中。雷帕霉素（Rap）可通過調節小膠質細胞活性和減少促炎介質的分泌，因而具有抗神經炎和神經保護特性。此外，Rap通過抑制mTOR活性促進自噬體形成，促使自噬體與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，可有效清除神經元細胞中受損或異常積累的蛋白質，如Aβ和α-突觸核蛋白。


  納米平臺的開發為有效治療AD提供了新途徑。其中，羥基封端的含磷樹狀大分子不僅可以作為納米載體有效穿透BBB，實現大腦的靶向給藥，而且還表現出獨特的生物特性，如抗炎和免疫調節活性。這些樹狀大分子在發揮內在生物活性的同時，還能抑制異常蛋白質聚集，因而在治療神經退行性疾病方面具有雙重潛力。與此同時，纖連蛋白（FN）通過抑制核因子卡巴-B（NF-κB）信號通路、減少促炎因子的表達以及促進巨噬細胞向M2表型轉化，表現出顯著的抗炎和抗氧化特性。FN在治療神經退行性疾病方面大有可為，特別是由于其Arg-Gly-Asp(RGD)序列可促進其靶向小膠質細胞表面整合素，增強其調節神經炎癥和氧化應激的能力。在近期的工作中，團隊構建了亞磷酸鈉或羥基封端的含磷樹狀大分子/FN納米藥物，通過結合樹狀大分子自身的抗炎活性以及FN的抗炎抗氧化活性協同緩解巨噬細胞或小膠質細胞內氧化應激，促進M2分型，降低炎癥反應，成功用于急性肺損傷/痛風、缺血性腦卒中和帕金森病的抗炎/抗氧化治療（ACS Nano 2024, 18, 2195-2209; Adv. Healthcare Mater. 2024, 13, 2401462; Bioact. Mater. 2024, 38, 45-54）。


  基于此，東華大學史向陽教授團隊與法國國家科學研究中心Jean-Pierre Majoral院士團隊合作構建了自身具有生物活性的羥基化的含磷樹枝狀大分子負載FN和Rap的納米復合物（R@A/F NCs），旨在利用綜合抗炎、抗氧化和自噬增強特性來高效治療AD（圖1）。第一代羥基端含磷樹狀大分子（AK76）通過靜電作用、氫鍵作用、陽離子-π作用和疏水作用與FN復合，并通過疏水作用進一步負載Rap。形成的R@A/F NCs具有良好的穩定性、細胞相容性和靶向性能。R@A/F NCs能在體外通過降低ROS水平、恢復線粒體膜電位（MMP）、增強自噬、促進小膠質細胞M2極化和抑制炎性細胞因子分泌等方式協同調節小膠質細胞。在樹狀大分子末端羥基的幫助下，R@A/F NCs可以穿過BBB，并通過減輕腦部炎癥、刺激自噬和促進Aβ蛋白降解來修復AD小鼠模型的認知和記憶損傷。


圖1. R@A/F NCs的合成及其用于AD的聯合治療示意圖。


  研究團隊發現當AK76/FN的質量比為2時，形成的納米復合物（NCs）具有最佳的水動力學直徑和較小的多分散指數（PDI，圖2A），所形成的NCs都顯示負的表面電位，這是由于FN的負電荷在與AK76復配后保持不變（圖2B）。制備的A/F NCs與R@A/F NCs呈現球形，在負載Rap后，尺寸由144.4 nm增加到187.3 nm（圖2C-D）。細胞毒性實驗結果表明R@A/F NCs對BV2細胞和SH-SY5Y細胞具有良好的細胞相容性（圖2E）。用R@A/F-Cy5.5 NCs處理的BV2細胞內的熒光強度遠高于用游離FN-Cy5.5處理組（圖2F-G）。細胞吞噬機制探究結果表明，大多數R@A/F NCs能通過網格蛋白依賴和巨胞飲介導的途徑被BV2細胞有效吸收，同時依賴于RGD介導的內吞途徑。


圖2. （A）不同AK76/FN質量比（1、2、4、6、8或10）下AK76、游離FN或A/F NCs的水動力學直徑和PDI以及（B）zeta電位。（C）AK76/FN質量比為2時R@A/F NCs的TEM圖像和（D）尺寸分布直方圖。（E）SH-SY5Y和BV2細胞經不同濃度AK76的R@A/F處理后的活力。（F）用PBS、游離FN-Cy5.5或A/F-Cy5.5 NCs處理BV2細胞后的相對熒光強度。（G）CLSM觀察用FN-Cy5.5或R@A/F-Cy5.5 NCs培養8小時后BV2細胞內的熒光。（H）用多種抑制劑預處理后再用R@A/F-Cy5.5 NCs培養2小時的BV2細胞的流式細胞術直方圖。


  研究團隊通過WB測試發現R@A/F NCs的處理能夠明顯降低Aβ挑戰的BV2細胞中P62蛋白（主要負責標記細胞內受損的蛋白質以通過自噬體降解）表達量，上調ATG5蛋白（自噬體形成和成熟的關鍵蛋白）的表達，表明有效促進線粒體自噬（圖3A-B）。通過CLSM觀察到R@A/F NCs的處理使得激活的BV2細胞的MMP恢復正常，促進線粒體平衡（圖3C）。同時，R@A/F NCs通過降低細胞內ROS的產生以緩解氧化應激（圖3D-E）。聯合AK76的抗炎活性和FN的抗炎/抗氧化活性，R@A/F NCs促進小膠質細胞M2極化，顯著降低促炎細胞因子包括TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌（圖3F-I）。通過量化免疫染色結果，我們發現R@A/F NCs處理導致Aβ挑戰的BV2細胞中p-p65表達顯著下調，表明R@A/F NCs能夠有效抑制NF-κB通路的激活，增強其抗炎功效（圖3J）。


圖3.（A）WB檢測分析不同處理后Aβ處理的BV2細胞中P62和ATG5的蛋白表達水平。（B）P62蛋白相對表達量的定量分析。（C）CLSM檢測不同材料處理的Aβ挑戰的BV2細胞中MMP變化。（D）CLSM觀察不同處理后Aβ挑戰的BV2細胞中ROS的表達。（E）不同處理后Aβ挑戰的BV2細胞中ROS表達的平均熒光強度。（F）通過流式細胞術評估不同處理后Aβ挑戰的BV2細胞中CD86和CD206的表達水平。ELISA分析BV2細胞中（G）TNF-α、（H）IL-1β和（I）IL-6的分泌水平。（J）通過CLSM觀察分析不同處理后Aβ挑戰的BV2細胞中p-p65的相對表達水平。


  研究團隊發現與FN-Cy5.5組相比，R@A/F-Cy5.5 NCs組在AD小鼠腦部的熒光信號明顯增加，并在注射后6小時達到峰值。這表明，R@A/F NCs成功穿透BBB并在大腦中蓄積，這可能是由于AK76含磷樹狀大分子表面的羥基引起的。在靜脈注射后6小時，肝臟和腎臟區域的熒光強度升高表明R@A/F-Cy5.5 NCs和FN-Cy5.5可通過網狀內皮系統被有效清除，凸顯了R@A/F NCs卓越的腦靶向和清除特性（圖4）。


圖4. （A）小鼠活體成像照片和（B）尾靜脈注射R@A/F-Cy5.5和FN-Cy5.5后0、0.5、1、2、4和6 h腦區的熒光值。（C）注射R@A/F-Cy5.5或FN-Cy5.5后6小時小鼠離體器官熒光成像照片和（D）主要器官（包括肺、心、肝、腎、脾和腦）的熒光值。


  由于NCs具有顯著的氧化應激緩解作用、抗炎特性、BBB通透性和精確靶向能力，研究團隊進一步通過新物體識別（NOR）測試、Y迷宮測試和莫里斯水迷宮（MWM）測試以評價R@A/F NCs的體內療效（圖5A）。在NOR測試中，R@A/F NCs處理后，識別指數最高，能夠明顯恢復AD小鼠對新奇事物的探索興趣，改善小鼠的認知功能（圖5B-C）。Y迷宮測試結果顯示R@A/F NCs治療的AD小鼠在新臂上探索的時間顯著增加，表明R@A/F NCs能夠緩解記憶缺陷。MWM測試結果表明，R@A/F NCs組的AD小鼠在目標象限內的游泳時間顯著增加，逃逸潛伏期在除正常組以外的所有治療組中最短，穿越平臺的次數增加，反映出R@A/F NCs治療后小鼠的記憶和學習能力明顯提高（圖5D-G）。


圖5. （A）AD小鼠的治療和測試安排。（B）不同組別AD小鼠在NOR測試中的代表路徑。（C）根據（B）計算的識別指數量化。（D）不同組別小鼠在MWM測試中的游泳軌跡。紅點表示起點，黑點表示終點。（E）不同組小鼠在目標象限內的時間、（F）逃逸潛伏期和（G）穿越平臺的次數。


  研究團隊進一步研究了R@A/F NCs治療的潛在機制。體內結果顯示，R@A/F NCs可有效降低腦內Aβ的積聚以及電離鈣結合適配分子-1（IBA-1）和膠質纖維酸性蛋白（GFAP）等活化標志物的表達，表明大腦中的炎癥狀態得到有效緩解。R@A/F NCs處理后，腦內ROS水平下降最為明顯，表明納米藥物中的各種成分具有協同作用，可通過Rap誘導自噬，并通過Rap和FN消除ROS。WB結果表明，R@A/F組處理后腦內mTOR表達水平最低，同時ATG5蛋白增加最多，自噬底物P62減少最明顯。CD206和CD86的免疫熒光分析進一步顯示，R@A/F NCs處理導致小鼠腦內CD86水平顯著降低，CD206表達明顯升高，表明腦內小膠質細胞的有效M2再極化。此外，經R@A/F NCs治療的小鼠腦部海馬細胞出現了良好的組織結構，神經元數量明顯恢復，與健康小鼠相當（圖6）。


圖6.（A）不同組小鼠腦部Aβ、IBA-1/GFAP和ROS的免疫熒光圖像。（B）Aβ、（C）GFAP和（D）IBA-1在不同組中的相對表達量。（E）mTOR、ATG5和P62的WB表達分析。（F）不同處理后小鼠腦部CD86/CD206的免疫熒光染色。（G）不同組海馬區的H&E染色和神經元的Nissl染色。


  簡而言之，該研究設計的納米藥物具有以下優勢：（1）以含磷樹狀大分子為基礎的遞送系統顯著提高了FN和Rap的生物利用度，同時末端羥基賦予NCs穿透受損BBB的能力，通過FN介導靶向過表達α4β1整合素的小膠質細胞，促進納米藥物靶向遞送至AD病變部位；（2）R@A/F NCs可協同AK76、FN和Rap的抗炎和抗氧化作用，促進氧化應激緩解、線粒體功能恢復、自噬增強和誘導小膠質細胞M2極化，從而協同抑制Aβ的聚集并改善AD認知缺陷。所開發的納米藥物結合了生物活性含磷樹狀大分子和多組分藥物治療AD的優勢，有望用于不同神經退行性疾病的免疫調節治療。


  以上研究成果以“Codelivery of Fibronectin and Rapamycin via Bioactive Phosphorus Dendrimers to Ameliorate Alzheimer’s Disease through Macrophage Autophagy, Oxidative Stress Alleviation and Polarization Modulation”為題，在線發表于國際著名期刊Nano Today（DOI: 10.1016/j.nantod.2025.102664）。東華大學生物與醫學工程學院史向陽教授為通訊作者，東華大學博士生詹夢偲和碩士生戴外從為共同第一作者。該工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、上海市科委等項目及中央高；究蒲袠I務費專項資金的資助。


  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102664

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（責任編輯：xu）
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