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  惡性黑色素瘤作為最具侵襲性的皮膚惡性腫瘤之一，其傳統治療手段臨床療效往往有限。化學動力學療法（CDT）因其優異的腫瘤選擇性和低毒性而備受關注，但單一療法效果受限，主要歸因于復雜的腫瘤微環境中過表達谷胱甘肽（GSH）、酸性pH及缺氧誘導的免疫抑制。因此，迫切需要開發能整合化學動力學治療與其他治療策略的多功能納米平臺，實現腫瘤精準成像與高效特異性治療。

  CRISPR/Cas9基因編輯技術能夠特異性敲除PD-L1基因，從而永久性阻斷PD-1/PD-L1免疫檢查點通路，從根本上抑制腫瘤的免疫逃逸。基于上述特性，該技術對免疫原性極強的黑色素瘤尤為使用。然而，腫瘤微環境（TME）的復雜病理特征，尤其是免疫抑制分子腺苷（ADO）的過度積累，嚴重限制了該技術的療效。在缺氧的TME中，CD39/CD73可將促炎性ATP代謝為ADO，顯著抑制免疫細胞功能。研究表明，改善腫瘤缺氧狀態可有效下調CD39/CD73表達，進而阻斷ADO介導的免疫抑制效應。

  基于此，東華大學郭睿教授/史向陽教授課團隊構建了一種基于MnO₂納米顆粒與CRISPR/Cas9-PD-L1基因編輯系統共遞送的仿生納米平臺，實現化學動力學治療與免疫治療的聯合治療（圖1）。研究團隊利用PEG修飾的PEI穩定MnO₂形成PEI-PEG@MnO₂（PPM）載體，隨后通過靜電吸附負載CRISPR/Cas9-PD-L1構建PPMC復合物，最后包覆B16-F10癌細胞膜形成PPMC@CM仿生納米顆粒。癌細胞膜仿生包被將賦予納米顆粒同源靶向特性和免疫逃逸功能，顯著提升了納米顆粒的遞送效率和腫瘤特異性富集能力。PPMC@CM進入細胞后，觸發溶酶體逃逸釋放CRISPR/Cas9-PD-L1，高效敲除PD-L1基因。此外，釋放的MnO₂緩解腫瘤缺氧，阻斷缺氧-腺苷免疫抑制通路，同時消耗腫瘤微環境中過量GSH以增強Mn²⁺介導的化學動力學治療效果，并實現腫瘤特異性T₁加權MRI成像。PPMC@CM通過聯合化學動力學-免疫治療抑制腫瘤生長并實現MRI監測，為黑色素瘤的診療一體化提供了創新性策略。

圖1. PPMC@CM的合成路線及其用于MRI引導的化學動力學/免疫治療的機制示意圖。

  TEM和XPS結果證實PPM的成功合成，平均粒徑為20.62 nm（圖2A-C）。瓊脂糖凝膠電泳實驗表明當N/P比≥0.5時，PPM能夠完全壓縮Cas9-PD-L1（圖2D）。綠色熒光蛋白轉染實驗表明，PPMC可以有效轉染質粒，并且最佳N/P為15（圖2E-G）。SDS-PAGE和TEM結果顯示B16-F10細胞膜成功包覆，PPMC@CM的平均粒徑為158.9 nm，細胞膜厚度約為12.2 nm（圖2H-I）。

圖2.（A）PPM的TEM圖像及（B）粒徑分布直方圖。（C）PPM中Mn 2p軌道的XPS能譜。（D）不同N/P下Cas9-PD-L1與PPM的瓊脂糖凝膠阻滯實驗。泳道1：DNA Marker（100-5000 bp）；泳道2：游離Cas9-PD-L1；泳道3-7：N/P分別為0.125、0.25、0.5、1和2。（E）通過共聚焦顯微鏡觀察B16-F10細胞經PBS、pDNA及PPMC（N/P = 5、10、15和20）轉染后的綠色熒光蛋白表達（比例尺：20 μM）。（F）B16-F10細胞經PBS、pDNA及PPMC（N/P = 5、10、15和20）轉染后的流式細胞術圖及（G）相對定量結果。（H）PPMC@CM的SDS-PAGE結果分析。（I）PPMC@CM的TEM圖像。

  研究團隊系統評估了材料的·OH/O₂生成能力及MR成像性能。MB降解實驗表明，PPM在模擬TME條件下展現出優異的·OH生成性能（圖3A）。PPMC@CM能有效催化H₂O₂分解產氧（圖3B），并實現Mn²⁺的響應性釋放（圖3C）。核磁共振分析證實，該材料具有GSH響應特性，可釋放Mn²⁺用于T₁加權MR成像（圖3C-D）。此外，PPMC@CM表現出良好的血液相容性（圖3F），證實其具備安全可靠的生物醫學應用潛力，為后續體內實驗奠定了基礎。

圖3.（A）PPM在不同條件下與MB 反應后的UV-vis譜圖（[MB] = 10 μg/mL，[NaHCO₃] = 25 mM，[H₂O₂] = 10 mM，[Mn] = 0.1mM）。（B）不同濃度材料分散體系中H₂O₂分解的O₂濃度隨時間變化曲線（[H₂O₂] = 10 mM）。（C）PPMC@CM在不同Mn濃度及GSH（10 mM）存在與否條件下的偽彩色磁共振成像圖和（D）1/T₁值與Mn濃度之間的線性擬合關系。（E）PPMC@CM在不同環境條件下Mn²⁺的累積釋放動力學曲線。（F）CPL@G5-BS在有無激光照射下652 nm處的紫外吸收強度對比。

  研究團隊選用B16-F10細胞進行體外實驗評價。細胞毒性分析表明，PPMC@CM具有最優的腫瘤細胞殺傷效果（圖4A）。細胞攝取實驗證實CM包覆顯著增強了材料的靶向攝取能力并賦予其免疫逃逸特性（圖4B-D）。通過溶酶體共定位及Western blot分析發現，PPMC@CM在4小時內被內化進入溶酶體，8小時后成功逃逸并進入細胞核，實現PD-L1基因敲除（圖4E-G）。

圖4.（A）不同材料對B16-F10細胞的細胞毒性評估。（B）B16-F10細胞或RAW264.7細胞與不同材料共孵育后細胞內的Mn含量。（C）B16-F10細胞與不同材料共孵育6小時后的流式細胞術分析圖及（D）平均熒光強度的。（E）PPMC@CM（Cy3標記Cas9-PD-L1）與B16-F10細胞共孵育2、4、8小時的共聚焦顯微鏡圖像及（F）相應的共定位熒光強度分析。比例尺: 10 μm。（G）Western blot檢測與不同材料共孵育后細胞PD-L1蛋白的表達水平及相應的定量分析結果。

  接下來，研究團隊探究了PPMC@CM如何調節B16-F10細胞中的氧化應激。PPMC@CM組誘導了最顯著的GSH耗竭、ROS產生和LPO積累（圖5A-E）。進一步研究發現，PPMC@CM處理后的B16-F10細胞凋亡率顯著增強（圖5F-G）。

圖5.（A）不同處理6小時后B16-F10細胞內GSH的相對水平。（B）激光共聚焦顯微鏡觀察B16-F10細胞與不同材料共孵育6小時后細胞內ROS水平。比例尺：20 μm。（C）流式細胞儀分析B16-F10細胞經不同處理6小時后的細胞內ROS水平和（D）定量分析。（E）通過CLSM觀察不同處理6小時后B16-F10細胞中LPO的表達水平。（F）流式細胞術分析及（G）定量統計B16-F10細胞經不同處理24小時后早期凋亡、晚期凋亡及壞死細胞的比例。

  團隊進一步評估了PPMC@CM對缺氧-腺苷軸的抑制作用。結果表明，PPMC@CM組顯著緩解了腫瘤細胞的缺氧狀態（圖6A），并明顯降低了HIF-1α的表達水平（圖6B）。通過WB實驗和ELISA檢測進一步證實，PPMC@CM能夠有效抑制CD39/CD73的表達及ADO的生成（圖6C-E）。綜上，PPMC@CM通過改善細胞內缺氧微環境，顯著抑制了缺氧-腺苷信號軸的激活，從而降低細胞外腺苷的水平（圖6F）。

圖6.（A）使用[Ru(dpp)₃]Cl₂探針檢測不同處理后B16-F10細胞中的O₂含量，比例尺：20 μm。缺氧條件下，B16-F10細胞經不同材料處理后（B）HIF-1α、（C）CD39和（D）CD73蛋白表達的Western blot分析及定量數據。（E）缺氧條件下，不同材料處理的B16-F10細胞中ADO水平。（F）PPMC@CM的抗腫瘤機制。

  研究團隊通過建立B16-F10腫瘤模型，評估了PPMC@CM在活體內的MR成像性能。結果顯示，給藥后兩組腫瘤部位的MR信號強度均迅速升高，并在0.5小時達到峰值后逐漸衰減，其中PPMC@CM組的信號強度顯著高于PPMC組（圖7A-B）。進一步分析PPMC@CM在體內的生物分布發現，注射0.5小時后，Mn元素在腫瘤組織中的蓄積量達到最高，隨后逐漸被代謝清除（圖7C-D）。

圖7.（A）瘤周注射PPMC或PPMC@CM后不同時間點腫瘤體內T₁加權MR成像圖及（B）腫瘤部位MR信噪比定量分析。不同時間點通過瘤周注射（C）PPMC和（D）PPMC@CM后，小鼠主要器官和腫瘤中的Mn元素含量。

  研究團隊系統評估了PPMC@CM對B16-F10荷瘤小鼠的抗腫瘤療效。結果顯示，治療期間各組小鼠體重無明顯變化，表明實驗材料均未表現出明顯毒性（圖8A-B）。PPMC@CM治療組表現出最優異的抗腫瘤效果，其腫瘤體積和重量均顯著低于其他組（圖8C-E）。進一步通過組織病理學分析（H&E、TUNEL和Ki67）證實，PPMC@CM能顯著誘導腫瘤組織壞死和細胞凋亡，同時有效抑制腫瘤細胞增殖（圖8F）。

圖8.（A）B16-F10小鼠腫瘤模型建立及抗腫瘤治療方案的示意圖。治療期間B16-F10荷瘤小鼠的（B）體重以及（C）腫瘤相對體積變化。（D）末次給藥后剝離腫瘤的實物照片和（E）剝離腫瘤的重量統計。（F）第13天B16-F10腫瘤組織的H&E、TUNEL和Ki-67染色。比例尺：20 μm。

  最后，研究團隊深入探究了PPMC@CM的抗腫瘤作用機制。免疫熒光染色與ELISA檢測結果顯示，PPMC@CM治療組腫瘤組織中PD-L1、HIF-1α、CD39及CD73的表達水平均顯著下調（圖9A-E）。同時，腫瘤部位的CD4⁺和CD8⁺T細胞的浸潤數量明顯增加（圖9G-I）。

圖9.（A）B16-F10腫瘤切片中PD-L1、HIF-1α、CD39和CD73的免疫熒光染色。比例尺：20 μm。不同治療組B16-F10腫瘤組織中（B）PD-L1、（C）HIF-1α、（D）CD39和（E）CD73在的表達定量分析（1：PBS；2：PPM；3：PPMC；4：PPMC@CM）。（F）不同治療組血清中ADO的含量。（G）不同治療組B16-F10腫瘤切片中CD4和CD8的免疫熒光染色。比例尺：20 μm。不同治療組B16-F10腫瘤切片中（H）CD4⁺ T細胞和（I）CD8⁺ T細胞數量定量分析。

  PPMC@CM可顯著促進脾臟中CD4⁺和CD8⁺ T細胞的增殖活化（圖10A-E），降低調節性T細胞（Tregs）的比例，并顯著提升血清中促炎細胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的表達水平（圖10F-H）。

圖10. 對不同處理后荷瘤小鼠脾臟（A）CD4⁺/CD8⁺ T細胞和（B）Tregs進行流式細胞術分析。（C）CD4⁺、（D）CD8⁺ T細胞比例和（E）Tregs比例的相應定量。不同組小鼠治療13天后血清中（F）TNF-α、（G）IFN-γ和（H）IL-6水平。

  簡而言之，團隊所構建的PPMC@CM納米平臺通過同源靶向作用在腫瘤部位高效富集，釋放的MnO₂可產生氧氣緩解腫瘤缺氧，同時消耗GSH以增強Mn²⁺介導的類芬頓反應，從而顯著提升CDT療效并實現腫瘤靶向MRI成像。此外，CRISPR/Cas9系統有效敲除PD-L1基因，同時腫瘤缺氧的改善能抑制免疫抑制性的缺氧-腺苷能軸，進一步增強免疫治療效果，激活強大的抗腫瘤免疫反應。本研究將CRISPR/Cas9-PD-L1系統與缺氧-腺苷軸抑制策略相結合，為設計黑色素瘤診療一體化的仿生納米平臺提供了新思路。

  以上研究成果以“A Biomimetic Nanoplatform Mediates Hypoxia-Adenosine Axis Disruption and PD-L1 Knockout for Enhanced MRI-Guided Chemodynamic-Immunotherapy”為題，在線發表于國際著名期刊 Acta Biomaterialia (DOI: 10.1016/j.actbio.2025.06.021 )。東華大學生物與醫學工程學院郭睿教授與史向陽教授為共同通訊作者，東華大學碩士研究生孫夢宇為第一作者。該工作得到了國家自然科學基金、上海市科學技術委員會等的資助。

  文章鏈接：https://doi.org/10.1016/j.actbio.2025.06.021